dengan air bebas ion MiliQ sebanyak tiga kali masing-masing 5 menit. Preparat tersebut kemudian diwarnai di-counterstain dengan hematoksilin agar terlihat
warna yang kontras antara inti sel yang mengadung SOD dan yang tidak. Preparat lalu dicelupkan ke dalam akuabides untuk memperkuat warna biru yang dibentuk
oleh hematoksilin. Selanjutnya preparat didehidrasi pada alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95, dan absolut I, II masing-masing beberapa detik, kemudian
absolut III selama 1 menit. Proses dilanjutkan dengan clearing pada xylol I, II beberapa detik dan xylol III selama 1 menit, dan diakhiri dengan mounting.
6. Analisis data
Pengamatan terhadap preparat yang telah diwarnai dengan HE dilakukan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan dilakukan secara kuantitatif
terhadap gambaran histologi organ usus halus. Data yang diambil ialah persentase kerusakan vili usus halus duodenum, jejunum, dan ileum. Persentase kerusakan
vili usus dihitung dengan rumus: kerusakan vili = jumlah vili yang rusak : jumlah total vili x 100
Hasil perhitungan dianalisis secara statistik dengan one way ANOVA dan uji lanjut Duncan.
Pengamatan terhadap preparat yang telah diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD dilakukan menggunakan mikroskop cahaya.
Pengamatan dilakukan secara kualitatif terhadap reaksi positif + yang terbentuk dari pewarnaan imunohistokimia Cu,Zn-SOD. Data yang diambil meliputi
intensitas dan distribusi warna coklat yang dihasilkan dari pewarnaan. Warna coklat merupakan reaksi positif + terhadap keberadaan enzim antioksidan
Cu,Zn-SOD pada sel-sel di jaringan usus halus. Semakin banyak nilai + berarti semakin tinggi kandungan enzim Cu,Zn-SOD nya. Data ini dianalisis secara
deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Histologi jaringan usus halus
Kerusakan vili pada usus halus dapat dilihat dari gambaran histologi jaringan usus halus tersebut. Keberadaan vili berpengaruh terhadap penyerapan
makanan dan kondisi kesehatan saluran pencernaan. Vili yang rusak tidak akan bisa menyerap makanan secara baik, sehingga asupan nutrisi bagi individu akan
berkurang dan kondisi kesehatan menurun Schiller Sellin 2006. Pada penelitian ini, persentase kerusakan vili mukosa usus halus duodenum, jejunum,
dan ileum tikus percobaan dapat dilihat pada Tabel 3. Analisis statistik menunjukkan pada hari ke-8 kerusakan vili duodenum
tidak berbeda nyata p0.05 untuk setiap kelompok perlakuan Gambar 7. Pada jejunum, kelompok perlakuan L. fermentum menunjukkan kerusakan vili yang
nyata p0.05 lebih rendah dibandingkan dengan dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif, namun tidak berbeda nyata p0.05 terhadap
kelompok perlakuan L. plantarum, L. plantarum + EPEC, dan L. fermentum + EPEC Gambar 8. Analisis statistik menunjukkan pemberian L. plantarum dan
L. fermentum pada ileum menimbulkan kerusakan vili yang tidak berbeda nyata p0.05, baik pada kelompok perlakuan L. plantarum, L. fermentum, L.
plantarum + EPEC, maupun L. fermentum + EPEC. Namun kelompok perlakuan L. plantarum dan L. fermentum menunjukkan kerusakan vili yang lebih rendah
secara nyata p0.05 dibandingkan dengan dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif Gambar 9.
Uji lanjut Duncan menunjukkan pada duodenum, jejunum, dan ileum, kerusakan vili kelompok kontrol positif tidak berbeda nyata p0.05 dengan
kelompok kontrol negatif. Kerusakan vili usus halus belum nyata terjadi pada hari ke-8 karena kelompok kontrol positif EPEC, L. plantarum + EPEC, dan L.
fermentum + EPEC belum diberi cekok EPEC. Berdasarkan pada analisis statistik pemberian L. plantarum dan L. fermentum belum menunjukkan hasil yang
berbeda nyata terhadap kesehatan vili duodenum, namun sudah mulai berefek baik pada vili ileum. Hal ini dimungkinkan karena jangka waktu pemberian L.
plantarum dan L. fermentum tergolong masih singkat, sehingga belum
menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap kesehatan vili usus halus tikus percobaan.
Tabel 3 Data persentase kerusakan vili usus halus
Perlakuan Persentase kerusakan vili Mean±SD
Duodenum Jejunum
Ileum
Hari ke-8 sebelum pemberian EPEC Kontrol negatif A
11.34±6.02
a
36.54±12.22
b
33.75±5.11
bc
L.plantarum B 12.45±4.38
a
17.14±4.12
ab
14.97±6.50
a
L.fermentum C 10.33±1.03
a
14.85±1.94
a
19.96±1.79
a
L.plantarum+EPEC D 13.00±4.24
a
25.09±4.01
ab
26.55±2.19
abc
L.fermentum+EPEC E 11.55±0.63
a
24.24±0.49
ab
20.64±0.65
ab
Kontrol positif F 11.45±2.05
a
30.88±2.89
b
34.92±1.31
c
Hari ke-15 pemberian EPEC Kontrol negatif A
22.87±3.01
bc
30.76±1.62
b
35.35±0.49
bc
L.plantarum B 16.15±.04
abc
21.29±.29
a
26.41±0.72
ab
L.fermentum C 9.68±.45
a
18.12±4.28
a
18.75±1.06
a
L.plantarum+EPEC D 19.09±2.69
abc
32.18±3.09
b
31.07±0.25
bc
L.fermentum+EPEC E 15.84±3.30
ab
21.33±6.60
a
25.91±8.97
ab
Kontrol positif F 26.85±9.16
b
44.69±1.85
c
39.00±5.66
c
Hari ke-22 setelah pemberian EPEC Kontrol negatif A
24.19±2.28
b
37.00±4.24
c
34.94±3.62
d
L.plantarum B 13.68±2.58
a
19.21±2.79
a
23.12±0.30
c
L.fermentum C 9.21±0.30
a
15.10±1.18
a
15.89±2.84
b
L.plantarum+EPEC D 24.66±2.35
b
46.85±2.62
d
34.72±1.97
d
L.fermentum+EPEC E 12.95±0.07
a
26.00±1.42
b
11.89±1.10
a
Kontrol positif F 32.50±3.54
c
54.85±1.21
e
42.07±1.52
e
Ket: angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada satu kolom pada masing-masing minggu menunjukan tidak berbeda nyata pada taraf 5
Penelitian Panigrahim 2008 menunjukkan bahwa dalam waktu 7 hari pemberian L. plantarum sudah bisa meningkatkan keragaman bakteri gram positif
dan menurunkan jumlah bakteri gram negatif pada usus individu yang baru lahir. Hasil penelitian Strompfová 2006 menunjukkan bahwa pemberian 1x10
9
cfuml L. fermentum selama 7 hari dapat meningkatkan populasi mikroba Lactobacillus
spp. sebanyak 55 dan Enterococcus spp. sebanyak 25 pada usus anjing yang sehat.
Gambar 7 Foto mikrograf duodenum tikus pada hari ke-8 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili tiap
kelompok perlakuan tidak berbeda nyata antara satu dan yang lainya. A
: kelompok kontrol negatif, B: kelompok perlakuan L. plantarum, C: kelompok perlakuan L. fermentum, D: kelompok perlakuan L.
plantarum + EPEC, E: kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC, F: kelompok kontrol positif EPEC. Skala = 200 µm.
Gambar 8 Foto mikrograf jejunum tikus pada hari ke-8 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili yang
lebih sedikit terdapat pada kelompok perlakuan L. fermentum C. Sedangkan kelompok perlakuan lainnya tidak berbeda nyata dengan
kontrol negatif. Kerusakan vili jejunum ditunjukkan oleh tanda . . A
: kelompok kontrol negatif, B: kelompok perlakuan L. plantarum, C
: kelompok perlakuan L. fermentum, D: kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, E: kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC,
F
: kelompok kontrol positif EPEC. Skala = 200 µm.
Gambar 9 Foto mikrograf ileum tikus pada hari ke-8 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili
kelompok perlakuan L. plantarum B dan L. fermentum C lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif A dan
kontrol positif F. Kerusakan vili ileum ditunjukkan oleh tanda A
: kelompok kontrol negatif, B: kelompok perlakuan L. plantarum, C
: kelompok perlakuan L. fermentum, D: kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, E: kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC,
F
: kelompok kontrol positif EPEC. Skala = 200 µm.
Pada terminasi hari ke-15, kelompok perlakuan L. fermentum memiliki kerusakan vili yang lebih kecil secara nyata p0.05 dibandingkan dengan
kelompok kontrol negatif dan kontrol positif di semua bagian usus halus. Pada duodenum, kelompok perlakuan L. plantarum menunjukkan kerusakan vili yang
tidak berbeda nyata p0.05 dengan kelompok perlakuan L. fermentum, L. plantarum + EPEC, maupun L. fermentum + EPEC. Hal ini menunjukkan
pemberian L. plantarum dan L. fermentum mempunyai efek yang hampir sama pada duodenum, baik saat dipapar maupun tidak dipapar EPEC Gambar 10.
Pada jejunum, kelompok perlakuan L. plantarum menunjukkan kerusakan vili yang tidak berbeda nyata p0.05 dengan kelompok perlakuan L. fermentum
dan L. fermentum + EPEC, namun lebih rendah secara nyata p0.05 dibandingkan dengan kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC. Hal ini
menunjukkan bahwa pemberian L. fermentum lebih baik dibandingkan dengan L. plantarum dalam mempertahankan vili jejunum dari serangan EPEC. Kelompok
perlakuan L. plantarum + EPEC menunjukkan kerusakan vili yang tinggi namun tidak berbeda nyata p0.05 dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini
menunjukkan bahwa L. plantarum masih mampu mempertahankan kondisi kesehatan vili usus halus seperti kondisi kontrol negatif Gambar 11.
Menurut Anderson et al. 2010, L. plantarum mempertinggi pertahanan selular pada mukosa usus halus dengan meningkatkan jumlah protein tight
junction. Tight junction adalah protein yang menghubungkan antara membran sel satu dan membran sel yang lain untuk mengatur perpindahan material interselular.
Meningkatnya jumlah tight juction akan menurunkan permeabilitas selular sehingga sel lebih selektif dalam menerima zat atau bahan-bahan asing dari luar.
Probiotik L. fermentum meningkatkan kesehatan dan pertahanan mukosa usus inang dengan beberapa mekanisme, di antaranya dia menempel dengan
sangat baik pada permukaan sel mukosa usus inang terutama di jejunum dan ileum Plant Conway 2001, sehingga bisa menghambat penempelan bakteri
patogen. Selain itu, L. fermentum juga mensekresikan metabolit antimikroba Mikelsaar Zilmer 2009 dan metabolit antiinflamasi Peran et al. 2005.
Menurut Yan dan Polk 2008, senyawa antimikroba bakteriosin yang dihasilkan oleh L. fermentum berfungsi untuk melawan bakteri gram positif.
Sedangkan asam laktat, asam asetat, dan asam propionat berfungsi untuk menurunkan pH lingkungan sehingga menghambat sebagian besar bakteri gram
negatif termasuk EPEC. Sebuah studi menunjukkan bahwa pH rendah berpengaruh terhadap permeabilitas membran luar bakteri gram negatif, saat
permeabilitas membran terganggu, senyawa antimikroba akan masuk dan menyebabkan kematian pada bakteri tersebut Alakomi et al. 2001.
Pada bagian ileum, kelompok perlakuan L. fermentum menunjukkan kerusakan vili yang rendah dan tidak berbeda nyata p0.05 dengan kelompok
perlakuan L. fermentum + EPEC dan L. plantarum. Analisis statistik menunjukkan bahwa kerusakan vili kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC
tidak berbeda nyata p0.05 dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa L. plantarum mampu mempertahankan kondisi
kerusakan vili usus halus yang dipapar EPEC seperti kondisi kelompok kontrol negatif. Paparan EPEC pada kelompok kontrol positif juga menimbulkan kondisi
kerusakan vili yang sama seperti kontrol negatif Gambar 12. Kerusakan vili duodenum dan ileum kelompok kontrol positif tidak berbeda
nyata p0.05 dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini karena aktivitas pertumbuhan mikroorganisme patogen di duodenum cenderung sedikit. Faktor
yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme tersebut di antaranya kondisi lumen duodenum yang kaya akan garam empedu dan sekreta pankreas Jonqueira
Carneiro 2005. Selain itu, pergerakan peristaltik duodenum yang cepat juga mencegah menetapnya patogen di duodenum Lu Walker 2001. Sedangkan
ileum dilengkapi dengan jaringan limfatik yang besar yaitu daun payer sebagai pertahanan terhadap patogen Samuelson 2007.
Di jejunum, kelompok kontrol positif memiliki persentase kerusakan vili yang paling tinggi secara nyata p0.05 dibandingkan dengan kelompok
perlakuan lain. Bakteri EPEC merupakan strain E. coli yang bersifat patogen. Patogenesa dari infeksi EPEC dimulai dengan berikatan secara kuat pada
permukaan epitel vili usus kemudian merusak mikrovili, dikenal dengan istilah “attaching and effacing” AE Grüenheid et al. 2001. Kerusakan mikrovili
akan menganggu penyerapan nutrisi serta menganggu keseimbangan osmotik sel epitel usus yang berakibat pada terjadinya diare Lapointe et al. 2009.
Gambar 10 Foto mikrograf duodenum tikus pada hari ke-15 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan
vili yang lebih sedikit terdapat pada kelompok perlakuan L. fermentum C. Sedangkan kerusakan vili kelompok perlakuan
lainnya tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol negatif A. Kerusakan vili duodenum ditunjukkan oleh tanda . A:
kelompok kontrol negatif, B: kelompok perlakuan L. plantarum, C: kelompok perlakuan L. fermentum, D: kelompok perlakuan L.
plantarum + EPEC, E: kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC, F
: kelompok kontrol positif EPEC. Skala = 200 µm.
Gambar 11 Foto mikrograf jejunum tikus pada hari ke-15 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili
terendah terdapat pada kelompok perlakuan L. plantarum B, L. fermentum C, dan L. fermentum + EPEC E. Kelompok kontrol
positif F memiliki kerusakan vili paling tinggi dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya. Kerusakan vili jejunum
ditunjukkan oleh tanda . A: kelompok kontrol negatif, B: kelompok perlakuan L. plantarum, C: kelompok perlakuan L.
fermentum, D: kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, E: kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC, F: kelompok kontrol
positif EPEC. Skala = 200 µm.
Gambar 12 Foto mikrograf ileum tikus pada hari ke-15 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili yang
lebih rendah terdapat pada kelompok perlakuan L. fermentum C. Sedangkan kelompok perlakuan lainnya tidak berbeda nyata
dengan kelompok kontrol negatif A. Kerusakan vili ileum ditunjukkan oleh tanda . A: kelompok kontrol negatif, B:
kelompok perlakuan L. plantarum, C: kelompok perlakuan L. fermentum, D: kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, E:
kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC, F: kelompok kontrol positif EPEC. Skala = 200 µm.
Bakteri EPEC terutama menyerang jejunum karena ukuran jejunum yang lebih panjang dibandingkan dengan dengan duodenum dan ileum sehingga
paparan EPEC cenderung lebih lama di jejunum. Selain itu, jejunum memiliki regenerasi sel epitel vili yang lebih lambat dibandingkan dengan dengan
duodenum dan ileum, sehingga eliminasi EPEC yang menempel pada sel epitel vili juga menjadi lebih lambat Louaka et al. 2009. Di jejunum pertahanan
mukosa yang dominan adalah sekresi mukus dari sel goblet, karena jumlah sel goblet terbanyak terdapat pada jejunum Samuelson 2007. Namun telah
dilaporkan bahwa EPEC mampu untuk tumbuh pada kondisi mukus yang tinggi seperti di jejunum Edelman et al. 2003.
Pada hari ke-22, persentase kerusakan vili usus halus tikus percobaan dapat dilihat pada Tabel 3. Pada duodenum, kerusakan vili pada kelompok perlakuan L.
fermentum, L. fermentum + EPEC, dan L. plantarum nyata p0.05 lebih kecil dibandingkan dengan kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, kontrol negatif,
dan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian tunggal L. plantarum dan L. fermentum dapat menekan kerusakan vili duodenum. Pada tikus yang
dipapar EPEC, L. fermentum dapat menekan kerusakan vili usus halus lebih besar dibandingkan dengan L. plantarum. Kerusakan vili usus kelompok perlakuan L.
plantarum + EPEC tidak berbeda nyata p0.05 dengan kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa L. plantarum bisa melawan serangan EPEC dan
mempertahankan kondisi mukosa duodenum seperti kondisi kontrol negatif Gambar 13.
Di jejunum dapat dilihat bahwa kelompok perlakuan L. plantarum dan L. fermentum memiliki nilai kerusakan vili yang nyata p0.05 paling kecil
dibandingkan dengan dengan perlakuan lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian tunggal L. plantarum maupun L. fermentum memberikan efek yang
paling baik dalam memelihara kondisi kesehatan vili jejunum. Analisis statistik menunjukkan bahwa kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC memiliki
kerusakan vili jejunum yang nyata P0.05 lebih besar dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa L. plantarum kurang
efektif melawan serangan EPEC yang terdapat pada jejunum Gambar 14.
Gambar 13 Foto mikrograf duodenum tikus pada hari ke-22 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili
yang paling sedikit terdapat pada kelompok perlakuan L. plantarum B, L. fermentum C, dan L. fermentum + EPEC E. Kerusakan
vili kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC sama dengan kontrol negatif A. Kerusakan vili duodenum ditunjukkan oleh tanda .
A
: kelompok kontrol negatif, B: kelompok perlakuan L. plantarum, C
: kelompok perlakuan L. fermentum, D: kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, E: kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC,
F
: kelompok kontrol positif EPEC. Skala = 200 µm.
Gambar 14 Foto mikrograf jejunum tikus pada hari ke-22 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili yang
paling sedikit terdapat pada kelompok perlakuan L. plantarum B dan L. fermentum C. Kerusakan vili kelompok perlakuan L.
plantarum + EPEC D dan kontrol positif F lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif A. Kerusakan vili jejunum
ditunjukkan oleh tanda . Skala = 200 µm.
Gambar 15 Foto mikrograf ileum tikus pada hari ke-22 yang diwarnai dengan hematoksilin-eosin HE. Dapat dilihat bahwa kerusakan vili yang
paling sedikit terdapat pada kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC E, disusul kelompok perlakuan L. fermentum C, L.
plantarum B, dan L. plantarum + EPEC D serta kelompok kontrol negatif A. Kelompok kontrol positif F memiliki
kerusakan vili paling tinggi. Kerusakan vili ileum ditunjukkan oleh tanda . Skala = 200 µm.
Pada ileum tikus percobaan, selain pada kelompok kontrol negatif dan kelompok perlakuan L. plantarum + EPEC, setiap kelompok memiliki kerusakan
vili yang berbeda nyata antara satu dan yang lainnya. Urutan kelompok perlakuan dengan kerusakan vili yang terkecil sampai yang terbesar, yaitu L. fermentum +
EPEC, L. fermentum, L. plantarum, L. plantarum + EPEC dan kontrol negatif, kemudian kontrol positif. Kerusakan vili kelompok perlakuan L. plantarum +
EPEC tidak berbeda nyata p0.05 dengan kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa L. plantarum mampu mempertahankan kondisi vili ileum terhadap
serangan EPEC seperti kondisi kontrol negatif. Jaringan duodenum, jejunum, dan ileum pada kelompok kontrol positif EPEC hari ke-22 mengalami kerusakan vili
yang nyata p0.05 paling tinggi dibandingkan dengan dengan kelompok perlakuan lainnya. Ini membuktikan bahwa EPEC menyebabkan kerusakan yang
berlanjut pada vili usus halus, walaupun pemberian dari luar telah dihentikan Gambar 15.
Hasil di atas menunjukkan bahwa pemberian probiotik dengan jumlah yang tepat bisa memperbaiki kondisi kesehatan mukosa saluran usus halus, sedangkan
yang tidak diberi probiotik mengalami kerusakan vili yang berlanjut. Penelitian Peran et al. 2005 menunjukkan bahwa pemberian L. fermentum selama 3
minggu bisa memperbaiki mukosa usus besar pada tikus colitis dengan merangsang pertumbuhan sel epitel dan sel goblet.
2. Kandungan Cu,Zn-SOD jaringan usus halus
