3 METODE
3.1 Bahan dan Alat
Baku eksternal 3-MCPD dan baku internal 3-MCPD-d
5
Fluka, Sigma- Aldrich, Phenylboronic acid PBA untuk derivatisasi Sigma-Aldrich, natrium
metoksida untuk transesterifikasi Merck, heksan Merck, etil asetat Merck, asam asetat glasial Merck, natrium klorida Merck, aseton Merck, methyl tert-
butyl ether MTBE Sigma-Aldrich, dan sampel minyak goreng sawit yang diperoleh dari supermarket dan pasar tradisional. Instrumen utama yang
digunakan untuk analisis adalah GC-MS yang dilengkapi autosampler, instrumen penunjang yang digunakan antara lain penangas air dan vorteks.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi dalam 3 tahap kegiatan, yaitu: penentuan modifikasi metode analisis, validasi metode analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak
goreng sawit secara GC-MS dan analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.
3.2.1 Penentuan Metode Analisis
Metode analisis yang digunakan adalah metode Wei haar yang
dimodifikasi, terdiri dari tiga tahapan yaitu ekstraksi, derivatisasi dan analisis dengan menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa GC-MS. 3-MCPD
dibebaskan dari 3-MCPD ester secara transesterifikasi dengan natrium metoksida dalam metanol, kemudian diderivatisasi dengan PBA, selanjutnya 3-MCPD
ditentukan dengan GC-MS. 3-MCPD-d
5
digunakan sebagai baku internal. Modifikasi dilakukan pada penggunaan larutan heksan sebagai pengekstraksi
menggantikan isoheksan dan kondisi penggunaan GC-MS Varian 320-MS lihat parameter penggunaan GC dan MS.
Penyiapan larutan baku
Larutan baku ekstrenal disiapkan dengan menimbang secara seksama lebih kurang 50 mg 3-MCPD, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL dan
dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mgmL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam
labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mgL. Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 25 mg 3-MCPD-d
5
, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh
konsentrasi 0.5 mgmL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan
konsentrasi 12.5 mgL. Sejumlah baku eksternal dan internal dari baku antara ditambahkan kedalam sampel minyak goreng sawit hingga didapatkan konsentrasi
16
tertentu. Sampel didiamkan pada suhu ruang minimal dua jam kemudian dilakukan preparasi seperti prosedur penyiapan larutan sampel.
Penyiapan larutan sampel
Preparasi sampel untuk penetapan 3-MCPD ester dilakukan dengan menggunakan 100 mg sampel minyak goreng sawit yang dimasukkan ke dalam
tabung kaca 10 mL bertutup ulir, ditambahkan 0.5 mL campuran MTBE dan etil asetat 8:2, baku internal dengan kadar 0.13 mgL, dicampur dan dibiarkan pada
suhu ruang sekurangnya 2 jam, kemudian ditambahkan 1 mL natrium metoksida 0.5 molL dalam metanol HPLC grade, divorteks selama 30 detik, kemudian
didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit, selanjutnya ditambahkan 3 mL heksan, 0.1 mL asam asetat glasial dan 3 mL natrium klorida 200 gL, divorteks
selama 30 detik. Setelah fase organik campuran tersebut dibuang, pada fase air ditambahkan 3 mL heksan dan kembali fase organik dibuang. Pada fase air
ditambahkan 250
L reagen penderivat 5 g PBA yang dilarutkan dalam 19 mL aseton dan 1 mL air, tabung ditutup dan panaskan pada suhu 80
o
C dalam penangas air selama 20 menit. Setelah didinginkan pada suhu ruang, derivat siklik
fenilboronat dari 3-MCPD diekstrak dengan 3 mL heksan Wei haar et al. 2007.
Fase organik dipisahkan dan dianalisis dengan GC-MS sesuai parameter penggunaan. Perlakuan yang sama juga dilakukan untuk penetapan 3-MCPD
bebas, namun tanpa penambahan natrium metoksida saat preparasi.
Parameter penggunaan GC
Kondisi penggunaan
Metode Wei haar
Metode Modifikasi
GCMS GC-MS Thermo Scientific
GC-MS 320-MS Varians yang dilengkapi autosampler
Kolom Rtx-5MS 30 m x 0.25 mm ID
x 0.25 m Restek, Varian
Rtx-5MS 30 m x 0.25 mm ID x 0.25
m Restek, Varian Suhu injector
250
o
C 180
o
C Suhu oven
80
o
C 1 menit, 300
o
C dengan laju 10
o
Cmenit 37 menit
60
o
C 1 menit, 90
o
C dengan laju 6
o
Cmenit 1 menit, 280
o
C dengan laju 20
o
Cmenit 5 menit Gas pembawa
Helium Helium
Aliran kolom 0.8 mLmenit
1.2 mLmenit Penyuntikan
Splitless Rasio split 10
Volume penyuntikan
1 L
1 L
17
Parameter penggunaan MS
Kondisi penggunaan Metode Wei
haar Metode Modifikasi
Mode aquisition Selected Ion Monitoring SIM
Selected Ion Monitoring SIM Mode ionisasi
Electron impact EI Electron impact EI
Suhu interface -
280
o
C Suhu ion source
- 200
o
C mz
196, 201 analisis kuantitatif; 147, 150 kualifikasi
147, 150 analisis kuantitatif; 91, 93, 196, 201 kualifikasi
3.2.2 Validasi Metode Analisis
Parameter validasi yang diuji meliputi linieritas dan rentang kerjanya, spesifisitas, presisi, akurasi, batas deteksi dan kuantifikasi. Identifikasi puncak
ditentukan dengan melihat waktu retensi, spektrum dan kromatogram sampel spike dengan baku pembanding Codex Stan 193-1995 2012; AOAC Official
Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998. Kuantifikasi dilakukan menggunakan kurva baku eksternal dengan delapan konsentrasi dan baku internal
dengan konsentrasi tetap yang ditambahkan kedalam sampel sampel spike.
Penyiapan larutan baku
Larutan baku eksternal disiapkan dengan menimbang secara seksama sejumlah kurang lebih 50 mg 3-MCPD, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100
mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mgmL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan baku induk tersebut dilarutkan dengan
etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mgL. Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 25 mg 3-MCPD-d
5
, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan dilarutkan dengan etil asetat
sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mgmL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL
sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mgL, selanjutnya larutan baku antara digunakan untuk pembuatan larutan baku kerja. Larutan baku kerja dibuat dalam
satu seri dengan konsentrasi tertentu, dengan cara menambahkan larutan baku antara pada volume yang telah ditetapkan ditambahkan kedalam 100 mg sampel
minyak goreng sawit. Sampel didiamkan sekurangnya selama dua jam sebelum dilakukan preparasi dan pengujian seperti prosedur pada 3.3.1.
Parameter validasi
Parameter validasi tergantung pada aplikasi, uji sampel, tujuan dari metode, dan pedoman dalam negeri, internasional atau peraturan yang berlaku. Untuk
metode analisis ini parameter validasi yang ditetapkan adalah linieritas, presisi, akurasi, spesifisitas, batas deteksi, dan batas kuantitasi Codex Stan 193-1995
2012; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998.
18
Spesifisitas
Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk merespon secara khusus analit
yang ditentukan tetapi tidak untuk komponen lain dari matriks, namun hanya sedikit metode yang benar-benar spesifik. Istilah ini lebih sering digunakan untuk
menyatakan bahwa parameter spesifisitas menunjukan bahwa metode dapat digunakan untuk menentukan analit secara kuantitatif tanpa adanya gangguan, hal
ini dapat dilihat pada kromatogram puncak analit yang terpisah.
Linieritas
Pada penentuan linieritas digunakan 8 baku eksternal dengan konsentrasi 0.01-0.34
gmL dan baku internal dengan konsentrasi 0.13 mgL. Linieritas dievaluasi dengan memetakan area daerah puncak yang merupakan rasio dari area
baku eksternal dan baku internal terhadap rasio konsentrasi baku eksternal dan baku internal dimana umumnya antara keduanya membentuk hubungan linier
yang dinyatakan dengan persamaan regresi dan koefisien korelasi r.
Persamaan regresi : y = bx + a y = rasio luas area puncak = luas area puncak baku eksternal 3- MCPDluas
area puncak baku internal 3-MCPD-d
5
x = rasio konsentrasi = konsentrasi baku eksternal 3-MCPD konsentrasi baku internal 3-MCPD-d
5
Akurasi
Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur dan nilai diterima, nilai benar atau nilai referensi, ditentukan secara rekoveri dengan penambahan baku
eksternal pada atau disekitar konsentrasi target, uji dilakukan pada satu konsentrasi dengan tujuh ulangan. Nilai rekoveri ditentukan dengan menggunakan
persamaan berikut:
Tabel 3.1 Batas rekoveri rata-rata pada matrik sampel Konsentrasi
Batas Rekoveri 100
98-101 10
95-102 1
92-105 0.1
90-108 0.01
85-110 10
gg ppm 80-115
0.1 gg ppm
75-120 10
gkg ppb 70-125
Sumber: AOAC 2002
Kategori