Validation of The Modified Weihaar’s Method for the Determination of 3 Monochloropropane 1,2 Diol (3 MCPD) and Its Ester in Palm oil

VALIDASI METODE WEI



HAAR YANG DIMODIFIKASI

UNTUK ANALISIS 3-CHLOROPROPANE-1,2-DIOL (3-MCPD)

DAN ESTERNYA PADA MINYAK GORENG SAWIT

TANTI LANOVIA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng Sawit adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juli 2013

Tanti Lanovia NIM F251090011

RINGKASAN

TANTI LANOVIA. Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng

Sawit. Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan PURWIYATNO HARIYADI.

Masalah keamanan pangan mencakup mata rantai pangan dari hulu ke hilir, dari ternak mulai dikembangbiakkan atau tanaman pangan mulai dibudidayakan hingga pangan dikonsumsi. Undang-undang Pangan No 18 tahun 2012 menyatakan bahwa keamanan pangan adalah kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan dari kemungkinan cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan membahayakan kesehatan manusia serta tidak bertentangan dengan agama, keyakinan, dan budaya masyarakat sehingga aman untuk dikonsumsi.

Senyawa 3-monochloropropane-1,2-diol atau 3-MCPD dan esternya merupakan salah satu kontaminan yang terbentuk pada saat proses pengolahan beberapa bahan pangan. Kedua senyawa tersebut ditemukan dalam minyak nabati dan beberapa pangan olahan, khususnya pada pangan yang menggunakan panas dalam proses produksi.

Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan esternya dalam pangan belum sepenuhnya dapat dipahami, namun sintesisnya diduga terjadi akibat adanya reaksi antara klorin dan lipid selama proses pengolahan, pemasakan dan penyimpanan yang dipicu oleh pemanasan atau reaksi enzim-katalis.

Pengembangan metode analisis untuk identifikasi 3-MCPD ester telah dilakukan baik secara langsung maupun tidak langsung. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis Weihaar yang dimodifikasi untuk penetapan kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit. Penelitian dilakukan dalam tiga tahap utama meliputi penentuan modifikasi metode analisis penetapan kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS; validasi metode Weihaar yang dimodifikasi untuk analisis 3-MCPD dan esternya; penetapan kadar 3-MCPD dalam beberapa minyak goreng sawit.

Hasil validasi metode analisis 3-MCPD dalam minyak goreng sawit sesuai dengan kriteria akurasi, presisi, linieritas, dan spesifisitas yang ditunjukkan oleh persamaan linear y = 0.076x + 0.005 dengan nilai koefesien korelasi (r) 0.994, rentang kerja 0.008 sampai 0.377 mg/L, batas deteksi 0.06 mg/kg, batas kuantitasi 0.20 mg/kg, presisi (koefisien variasi (KV)) 6.16%, dan akurasi (persen rekoveri) antara 95.83-113.27%. Metode analisis ini dapat diaplikasikan untuk menentukan 3-MCPD dan esternya pada minyak goreng sawit. Kadar 3-MCPD ester dihitung sebagai selisih 3-MCPD total dan 3-MCPD. Hasil analisis 3-MCPD total pada beberapa sampel minyak goreng sawit komersial didapatkan dengan kisaran konsentrasi 13.94-34.52 mg/kg. Sampel dengan kandungan diasilgliserida yang tinggi akan memberikan hasil pengujian yang tinggi pula pada kadar 3-MCPD dengan koefesien korelasi sebesar (r) 0.752.

SUMMARY

TANTI LANOVIA. Validation of The Modified Weihaar’s Method for the Determination of 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) and Its Ester in Palm oil. Supervised by NURI ANDARWULAN and PURWIYATNO HARIYADI.

Food safety problems may occur throughout the food chain from farm to fork. Food Law (law No. 18, 2012) stated that food safety is condition and efforts needed to prevent food from contamination of biological, chemical and other agents, that may interfere, harm, and harmful to human health and do not contradict with religions, beliefs, and culture of the society so that it will be safe to be consumed.

The compound of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) and its ester are contaminants formed during the food processing. Both of these compounds are found in vegetables oil and some processed food, especially food processed using heat in the production process.

The mechanism of 3-MCPD formation and its esters has not been fully established. It has been hypothesized that 3-MCPD was formed by reaction between chlorine and lipids during cooking and storage process of food, that may be trigered by heat or enzyme-catalyzed reaction. Consequently, validated analytical method for analysis of 3-MCPD and its ester is needed.

The research aims were to validate the modified Weihaar's method of analysis of 3-MCPD and 3-MCPD esters in refined palm oil. The research was conducted in three main stages including determining the analysis method to determine the levels of 3-MCPD and its esters in palm oil using GC-MS; validation of analysis methods; and determining the levels of 3-MCPD in several product of palm oil.

Validation result shows the following: A linear regression line has an equation of the form y = 0.076x + 0.005, where x is area ratio of standard external and standard internal and y is concentration ratio of external standard and internal standard. The linearity was showed by corelation coefficient (r) 0.994; linear response was obtained between 0.008 and 0.377 mg/L; limit of detection was 0.06 mg/kg, limit of quantification was 0.20 mg/kg, precision (relative standard deviation (RSD)) was 6.16%, and accuracy (as percentage of recovery) was in range 95.83-113.27%. This result indicated that the modified method was valuable and sensitive for detection of 3-MCPD and 3-MCPD esters. Using the validated method, the 3-MCPD esters in commercial palm oil sample determined and calculated as the difference between total 3-MCPD and free 3-MCPD, was 13.24 mg/kg. The total 3-MCPD in several palm oil give result on concentration range 13.94-34.52 mg/kg. These results also showed that there was a correlation between 3-MCPD with diacylglyceride (DAG). The sampel with high DAG contents give a high test results of 3-MCPD, this relationship was expressed by the coefficient of correlation (r) 0.752.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang menguntip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

VALIDASI METODE WEI



HAAR YANG DIMODIFIKASI

UNTUK ANALISIS 3-CHLOROPROPANE-1,2-DIOL (3-MCPD)

DAN ESTERNYA PADA MINYAK GORENG SAWIT

TANTI LANOVIA

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Judul : Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng Sawit

Nama : Tanti Lanovia NIM : F251090011

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr Ir Nuri Andarwulan, MSi Ketua

Prof Dr Ir Purwiyatno Hariyadi, MSc Anggota

Diketahui oleh

A.n. Ketua Program Studi Ilmu Pangan

Dr Ir Feri Kusnandar, M.Sc

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkat dan rahmat-Nya karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang berjudul Validasi Metode Weihaar yang Dimodifikasi untuk Analisis 3-Monochloropropane-1,2-Diol (3-MCPD) dan Esternya pada Minyak Goreng Sawit ini merupakan bagian dari dan tesis dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Sains Mayor Ilmu Pangan pada Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor.

Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan penelitian dan penyusunan tesis ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Ir Nuri Andarwulan, MSi dan Prof Dr Ir Purwiyatno Hariyadi, MSc. yang telah memberikan bimbingan. Ucapan terima kasih juga penulis haturkan bagi Pimpinan Pusat Pengujian Obat dan Makanan, khususnya Kepala Bagian Pangan dan Pimpinan Pusat Riset Obat dan Makanan yang telah memberikan kesempatan untuk melakukan penelitian. Selain itu, ucapan terima kasih juga dihaturkan kepada keluarga dan teman-teman atas dukungan moril dan materil dalam menyelesaikan penelitian ini.

Akhir kata, saya berharap Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu.

Bogor, Juli 2013

Tanti Lanovia

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL x

DAFTAR GAMBAR x

DAFTAR LAMPIRAN xi

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 3

Tujuan Penelitian 4

Manfaat Penelitian 4

2 TINJAUAN PUSTAKA 5

Senyawa 3-MCPD dan Esternya 5

Validasi Metode Analisis 9

Minyak Sawit 12

3 METODE 15

Bahan dan Alat 15

Metode Penelitian 15

Penentuan Metode Analisis 15

Validasi Metode Analisis 17

Penyiapan Larutan Baku 17

Parameter Validasi 18

Analisis 3-MCPD dan Esternya dalam Minyak Goreng Sawit 21

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 23

Penetapan Modifikasi Metode Analisis 23

Validasi Metode Analisis 28

Analisis 3-MCPD dan Esternya dalam Minyak Goreng Sawit 31

5 SIMPULAN DAN SARAN 34

Simpulan 34

Saran 34

6 DAFTAR PUSTAKA 35

7 LAMPIRAN 39

DAFTAR TABEL

2.1 Kadar 3-MCPD ester dalam minyak nabati 6

2.2 Kadar 3-MCPD dan esternya dalam makanan 6

2.3 Mekanisme pembentukan 3-MCPD dalam pangan 7

2.4 Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di Indonesia 9 2.5

2.6

Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di beberapa negara Pembentukkan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester pada proses pengolahan minyak goreng sawit

9 13 3.1 Batas rekoveri rata-rata pada matrik sampel 18 3.2 Nilai koefesien variasi Horwitz pada beberapa konsentrasi analit 20

4.1 Tahapan pengujian dan hasilnya 23

4.2 Karakteristik isoheksan dan heksan 24

4.3 Karakteristik ion (m/z) pada spektrum massa 3-MCPD dan 3-MCPD-d5

terderivatisasi

28 4.4 Nilai LOD dan LOQ dari beberapa jenis bahan pangan 30 4.5 Hasil uji presisi, rekoveri, batas deteksi dan batas kuantitasi 30 4.6 Kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD dalam minyak goreng sawit 31 4.7 Kadar 3-MCPD total, DAG, TAG dan ALB dalam minyak goreng

sawit komersial

32

DAFTAR GAMBAR

2.1 Struktur 3-MCPD dan esternya 5

2.2 Pembentukan 3-MCPD dan esternya dari asilgliserol 8 2.3 Tahapan proses refining minyak sawit komersial secara kimiawi dan

fisik

13

3.1 Kurva terompet Horwitz 20

4.1 Spektrum massa hasil derivatisasi PBA untuk 3-MCPD-d5 dan

3-MCPD

25 4.2 Kromatogram TIC derivatisasi 3-MCPD-d5 dan MCPD (A),

3-MCPD-d5 m/z 201 (B), 3-MCPD-d5 m/z 150 (C), 3-MCPD m/z 196

(D), 3-MCPD m/z 147 (E)

26

4.3 Kromatogram ion m/z 91 (7A), 147 (7C), 196 (7E) (3-MCPD) dan ion m/z 93 (7B), 150 (7D), 201 (7F) (3-MCPD-d5)

27 4.4 Kurva linearitas 3-MCPD dalam blanko sampel minyak goreng sawit 29

4.5 Kromatogram 3-MCPD pada ion m/z 147 29

4.6 Hubungan antara diasilgliserida dengan 3-MCPD yang terkandung dalam minyak goreng sawit

DAFTAR LAMPIRAN

1 Hasil pengujian untuk linearitas dan rentang kerja baku pembanding 39 2 Hasil pengujian rekoveri untuk mendapatkan data akurasi 39

3 Hasil pengujian LOD dan LOQ 40

1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Masalah keamanan pangan mencakup mata rantai pangan dari hulu ke hilir, dari ternak mulai dikembangbiakkan atau tanaman pangan mulai dibudidayakan hingga pangan dikonsumsi. Undang-undang Pangan No 18 tahun 2012 menyatakan bahwa keamanan pangan adalah kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan dari kemungkinan cemaran biologis, kimia, dan benda lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan membahayakan kesehatan manusia serta tidak bertentangan dengan agama, keyakinan, dan budaya masyarakat sehingga aman untuk dikonsumsi.

Terbukanya wawasan dan meningkatnya kesadaran konsumen terhadap pentingnya jaminan keamanan dan mutu pangan yang didukung oleh perkembangan teknologi juga kemajuan teknik deteksi dan analisis di laboratorium, sehingga ditemukan kontaminan baru terkait dengan keamanan pangan. Kontaminan dalam bahan pangan, cemaran lingkungan dan proses pengolahan (processing contaminant). Processing contaminants yaitu kontaminan yang disintesis selama proses pengolahan pangan terutama selama proses pemanasan, dan fermentasi. Kontaminan ini tidak terdapat pada bahan baku sebelum diolah tetapi dibentuk oleh reaksi kimia tertentu selama proses pengolahan. Keberadaan kontaminan ini tidak bisa dihindari, namun pemilihan dan pengendalian teknologi pengolahan yang lebih baik perlu dilakukan untuk meminimalkan pembentukan kontaminan tersebut (Hariyadi 2008).

Kontaminan dalam pangan merupakan sesuatu yang tidak dapat diterima dari segi kesehatan dan hal ini diatur oleh The Council Regulation (EEC) 315/93 tahun 1993. Peraturan tersebut menyatakan: 1) pangan yang terkontaminasi dan telah terbukti mengakibatkan toksisitas dan mengganggu kesehatan tidak boleh dipasarkan; 2) tingkat kontaminasi ditekan serendah mungkin dengan menerapkan Cara Produksi Pangan yang Baik (CPPB) dan sistem distribusi dan 3) kesehatan masyarakat harus dilindungi dengan mengatur batas maksimum kontaminan dalam pangan, termasuk cara sampling dan metode analisis yang digunakan (Larsen 2009).

Kontaminan yang terbentuk pada saat proses pengolahan beberapa bahan pangan diantaranya adalah 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) dan esternya (Stadler et al. 2009). Pada tahun 1978 senyawa 3-MCPD ditemukan pada hydrolyzed vegetable proteins (HVP) dan kecap tahun (Watkins 2009; Stadler et al. 2009). Hasil penelitian pada tahun 1980 oleh Velisek et al. melaporkan penemuan 3-MCPD ester dalam HVP, namun hasil penelitian ini tidak ditindaklanjuti hingga tahun 2004 saat ditemukan pada pangan olahan (Hrncirik 2010). Kedua senyawa tersebut selanjutnya juga ditemukan dalam beberapa pangan olahan dan minyak nabati. Senyawa 3-MCPD ester ditemukan pada semua jenis minyak nabati dengan kadar bervariasi antara 0.6-14 ppm, dengan kandungan tertinggi terdapat pada minyak goreng sawit (Greyt 2012). Senyawa 3-MCPD ditemukan pula pada

2

pangan yang menggunakan panas dalam proses produksi, antara lain kentang goreng, donat, kreker asin, remah roti, dark malt, dan pangan fermentasi seperti haring asin dan sosis ditemukan 3-MCPD dengan kadar bervariasi antara 0.14 dan 6.10 mg/kg, selain itu ditemukan juga 3-MCPD ester dalam pangan yang kadarnya mencapai 5 sampai 396 kali lebih tinggi dari 3-MCPD (Svejkovska et al. 2004).

Minyak goreng sawit saat ini merupakan minyak nabati dengan jumlah konsumsi terbanyak yang digunakan sebagian besar masyarakat Indonesia dalam pada proses pengolahan, demikian pula pada industri pengolahan pangan. Sehubungan dengan penggunaan minyak goreng sawit yang luas tersebut maka adanya 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit patut menjadi perhatian. Hal ini sangat sulit dihindari karena selain faktor pengolahan minyak juga dipengaruhi oleh kebiasaan konsumen yang lebih menyukai jenis pangan yang diolah dengan cara digoreng daripada menggunakan cara pengolahan lainnya seperti rebus dan panggang. Selain itu keberadaan senyawa 3-MCPD ester dalam minyak nabati perlu mendapat perhatian karena bahan ini juga digunakan sebagai ingredient pada makanan bayi (Franke et al. 2009).

Hasil penelitian yang dilakukan oleh The Ministry for Nutrition and

Rural Areas Baden-Wurttemberg di Jerman melaporkan pangan yang

mengandung 3-MCPD dengan kadar tinggi adalah margarin, minyak nabati, pangan mengandung lemak termasuk makanan pendamping ASI. Penelitian ini juga menyebutkan bahwa hanya minyak nabati yang diproses tanpa tahapan pemanasan (seperti minyak zaitun murni) yang tidak mengandung 3-MCPD ester. Dikatakan bahwa 3-MCPD ester terbentuk pada suhu tinggi dan diduga terbentuk selama proses deodorisasi minyak nabati yang merupakan tahap akhir proses pemurnian untuk menghilangkan bau dan memperbaiki rasa (Larsen 2009).

Laporan uji klinik menyatakan bahwa 3-MCPD mempengaruhi ginjal hewan uji dan menurunkan kesuburan hewan uji jantan, namun belum ada laporan tentang uji klinik dan epidemiologi terhadap manusia. Batasan 3-MCPD dalam pangan ditetapkan dengan tolerable daily intake (TDI) 2

μg/kg bb (berat badan) oleh Commission Regulation (EC) No 1881/2006 sedangkan European Union menetapkan batasan maksimal dalam HVP dan kecap sebesar 0.02 mg/kg (cairan dengan 40% bahan kering). Saat ini belum ada ketentuan terkait keamanan dan batas asupan harian untuk 3-MCPD ester serta bukti yang menunjukkan adanya gangguan kesehatan yang disebabkan oleh MCPD ester seperti halnya yang disebabkan oleh 3-MCPD. Namun keberadaan 3-MCPD ester tetap menimbulkan kekhawatiran, karena dianggap sebagai sumber pembentukan 3-MCPD. European Food Safety Authority (EFSA) dan German Federal Institute for Risk Assessment (Bundesinstitut fur Risikobewertung, BfR) memperkirakan hampir semua 3-MCPD ester akan diubah menjadi 3-MCPD oleh enzim lipase selama proses pencernaan sehingga dikeluarkan himbauan kepada pihak industri pangan untuk meminimalkan kadar 3-MCPD ester dalam pangan (Karasek et al. 2010) dengan menerapkan Cara Produksi Pangan yang Baik (CPPB). Namun belum ada informasi proses metabolisme,

3

hidrolisis ataupun biosintesisnya didalam tubuh, serta penyimpanan dan pengaruhnya terhadap jaringan tubuh (Karsulinova et al. 2007).

The European Commision’s Join Research Centre pada tahun 2009 menyelenggarakan uji profisiensi untuk menilai kemampuan laboratorium dalam melakukan pengujian 3-MCPD ester yang diikuti oleh 34 laboratorium pada 11 negara Uni Eropa, Swiss dan Makedonia. Kinerja laboratorium pada pengujian 3-MCPD ester dalam minyak zaitun menunjukkan 85% laboratorium memberikan hasil yang memuaskan sedangkan untuk minyak goreng sawit hanya 56% (Karasek et al. 2010). Dari hasil uji profisiensi tersebut mengindikasikan bahwa perlu dilakukan validasi metode analisis sebelum melakukan pengujian rutin dengan menggunakan metode tersebut.

Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan esternya dalam pangan belum sepenuhnya dapat dipahami. Sintesisnya diduga terjadi karena adanya reaksi antara klorin dan lipid selama proses pengolahan, pemasakan dan penyimpanan yang dipicu oleh pemanasan atau reaksi enzim-katalis (Watkins 2009). Faktor-faktor pembentukkan 3-MCPD adalah lesitin, asilgliserol, gliserol dan fosfolipid, sedangkan 3-MCPD ester dapat terbentuk dari fosfolipid dan gliserol (Velisek et al. 2003). Penelitian yang dilakukan Svejkovska et al. (2006) menemukan bahwa pembentukan 3-MCPD ester tergantung pada air, lemak dan kandungan garam dalam minyak serta dipengaruhi oleh suhu. Kadar 3-MCPD ester hasil pengujian berbanding lurus dengan konsentrasi minyak dan natrium klorida sehingga membuktikan bahwa 3-MCPD ester adalah komponen yang tidak stabil dan relatif mudah terurai selama pemanasan.

1.2 Perumusan Masalah

Kontaminan 3-MCPD dalam pangan merupakan hal yang perlu menjadi perhatian, membutuhkan tindak lanjut dan inisiatif pemerintah dan produsen pangan terhadap beberapa hal berikut ini: 1) ketersediaan metode analisis yang tervalidasi, termasuk preparasi sampel pada beberapa bahan pangan untuk mendapatkan hasil analisis yang akurat dan terpercaya; 2) riset mengenai pembentukan 3-MCPD dari esternya; 3) investigasi terhadap mekanisme pembentukan 3-MCPD ester selama proses pemurnian minyak nabati yang dilakukan untuk menurunkan jumlah 3-MCPD ester dan resiko minimal serta batasannya dalam minyak nabati; 4) penurunan batas resiko harus ditetapkan dan diaplikasikan pada proses produksi oleh produsen minyak nabati (Larsen 2009).

Pengembangan metode analisis 3-MCPD masih terbatas, terutama jenis matriksnya, serta belum adanya metode analisis terstandar, sehingga pihak berwenang lebih memilih metode analisis dengan parameter uji validasi yang lengkap sebagai pengganti metode standar. (Hrncirik et al. 2011).

Permasalahan tentang regulasi dan penetapan metode analisis standar dalam penentuan 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit belum ditetapkan oleh lembaga resmi pengatur standarisasi di Indonesia sebagai

4

salah satu negara penghasil minyak goreng sawit terbesar, sehingga perlu dilakukan penetapan metode analisis tervalidasi yang dapat digunakan untuk analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk memvalidasi metode analisis Weihaar yang dimodifikasi untuk analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit dan menentukan kadar 3-MCPD ester dalam minyak goreng sawit komersial yang beredar dipasaran. Penelitian dilakukan dalam tiga tahap. Tahap pertama menentukan metode analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS yang bertujuan untuk mendapatkan metode yang dapat diterapkan sesuai dengan kondisi laboratorium. Tahap kedua yaitu validasi metode analisis. Tahap ketiga adalah menetapkan kadar 3-MCPD dalam beberapa minyak goreng sawit, untuk mendapatkan gambaran kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD ester dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat menentukan metode analisis tervalidasi pada analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS sehingga didapatkan hasil pengujian yang terpercaya dan dapat dipertanggungjawabkan serta dapat diaplikasikan pada pengujian selanjutnya.

2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Senyawa 3-MCPD dan esternya

Monokloropropandiol adalah nama umum dari 3-kloro-1,2-dihidroksipropan (3-chloro-1,2-dihydroxypropane) lebih populer dengan nama 3-MCPD yang merujuk pada 3-MCPD bebas, merupakan salah satu dari grup propanol yang dikategorikan sebagai kontaminan kimia. Senyawa 3-MCPD seringkali ditemukan dalam pangan dan bahan tambahan pangan sebagai hasil proses pengolahan pangan dan atau penyimpanan. Senyawa 3-MCPD ester merupakan 3-3-MCPD yang teresterifikasi dengan gliserida. Senyawa ini menjadi isu regulasi setelah dilaporkan oleh beberapa peneliti bahwa 3-MCPD ester terdapat dalam minyak dan lemak. (Svejkovská et al. 2004; Weißhaar 2008; Zelinkova et al. 2006). Struktur 3-MCPD dan esternya dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Struktur 3-MCPD dan esternya (Zelinková et al. 2006) Senyawa 3-MCPD dikenal luas sebagai kontaminan pada acid-hydrolyzed protein vegetable (acid-HPV) yang biasanya digunakan sebagai penambah rasa pada makanan seperti sop, makanan siap saji, snack, kaldu dan kecap kedelai. Penelitian yang dilakukan oleh El Ramy (2006) menemukan adanya senyawa 3-MCPD pada produk serelia panggang dan sosis fermentasi. Kadar 3-MCPD dan esternya dalam pangan dapat dilihat pada Tabel 2.2. Pada minyak nabati kadar 3-MCPD terbagi atas 3 tingkatan yaitu tingkat rendah dengan kadar 0.5-1.5 mg/kg termasuk diantaranya minyak rapeseed, kedelai, kelapa dan bunga matahari, sedangkan tingkat sedang dengan kadar 1.5-4 mg/kg termasuk diantaranya minyak safflower, kacang tanah, zaitun, biji kapas dan dedak padi, sementara tingkat tinggi dengan kadar lebih dari 4 mg/kg termasuk diantaranya lemak terhidrogenasi, sawit dan fraksi minyak sawit (Tabel 2.1).

Peningkatan kadar kontaminan 3-MCPD disebabkan oleh adanya lemak dan garam selama proses pemanasan beberapa bahan pangan (Abu-El-Haj et al 2005). Kadar 3-MCPD dalam pangan tergantung pada suhu proses pengolahan dan kandungan lipid, gliserol, garam dan air sedangkan prekursor pembentukan senyawa 3-MCPD adalah asilgliserol dan gliserol. Prekursor ini bereaksi dengan nukleofil bermuatan negatif yaitu hidroksil dan anion klorida sehingga membentuk 3-MCPD ester. Senyawa 3-MCPD

6

merupakan hasil hidrolisis 3-MCPD ester melalui reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase. Pada penelitian selanjutnya monoasilgliserol dan fosfolipid yang terdapat pada zat pengembang adonan roti juga merupakan prekursor yg penting pada pembentukan 3-MCPD dalam adonan roti (Zelinkova et al. 2006).

Tabel 2.1 Kadar 3-MCPD ester dalam minyak nabati Minyak Jumlah Sampel Kadar rata-rata

(mg/kg)

Kadar Tertinggi (mg/kg)

Rapeseed 10 1 1

Bunga matahari 5 2 4

Jagung 4 7 9

Sawit 70 6 14

Kedelai 11 0.5 0.6

Kelapa 3 7 7.5

Sumber: Greyt (2012)

Tabel 2.2 Kadar 3-MCPD dan esternya dalam makanan

Bahan makanan

3-MCPD 3-MCPDn 3-MCPD ester g/kg RSD g/kg g/kg

lemak RSD g/kg

Acar zaitun 13.93 1.0 23.70 <3.30 — <0.28 Kopi sangria 16.15 4.3 6.56 <3.30 — <0.33

Kacang sangria 22.10 2.0 9.05 Nd — —

Light malt 9.55 5.2 4.00 <3.30 — 0.05

Dark malt 27.90 2.6 11.34 36.51 1.7 0.58

Roti kering 11.05 2.0 4.60 6.31 1.3 0.42 Kreker asin 10.72 2.5 4.44 12.52 0.3 0.14

Donat 16.58 2.3 8.53 3.95 0.9 1.21

Keripik kentang 14.48 2.4 5.91 <3.30 — <1.21 Kentang goreng 15.41 1.3 9.10 36.77 2.42 6.10

Soft salami 14.03 3.8 12.73 <3.30 — <0.93

Salami fermentasi 47.63 1.0 24.75 <3.30 — <1.49 Daging asap (ham) 23.18 1.8 15.65 <3.30 — <1.62

Bologna ham 26.24 0.7 16.63 Nd — nd

Ayam panggang 26.04 2.2 24.07 <3.30 — <0.43 Makarel asap 18.62 1.4 19.27 <3.30 — <0.53

Haring asin 28.19 7.0 38.86 3.57 3.3 0.28

Keju parmesan 82.67 0.4 43.06 nd — nd

Keju olahan 29.83 2.8 26.53 <3.30 — <0.77 Keju feta 12.98 1.2 12.39 <3.30 — <0.58 Sumber: Svejkovska et al. (2004) RSD=relative standard deviation (%); 3-MCPDn= 40%

dihitung terhadap bobot kering; nd=dibawah batas deteksi (not detected); <3.30 mg/kg lemak= dibawah batas kuantitasi

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui mekanisme pembentukkan 3-MCPD dan esternya dalam pangan, seperti tercantum dalam Tabel 2.3.

7

Tabel 2.3 Mekanisme pembentukan 3-MCPD dalam pangan

Substrat Mekanisme Sumber

Asam klorida dan gliserol atau

asilgliserol

Hidrolisis asam klorida atau gas klorida yang direaksikan dengan gliserol dengan atau tanpa adanya asam asetat glasial terjadi dengan pemanasan pada suhu 100-130 °C selama 4-24 jam. Senyawa 3-MCPD terbentuk dari reaksi antara asam klorida dengan residu minyak nabati.

Zelinkova et al. (2006)

Asam hipoklorit dan alil alkohol

Asam hipoklorit yang berasal dari klorin dan air ditambahkan kepada alil alkohol yang memiliki ikatan rangkap, reaksi ini membutuhkan pemanasan pada suhu 50-60 oC. Pembentukan 3-MCPD ini diduga terjadi pada produk olahan bawang putih.

Stadler et al. (2009).

Natrium klorida dan gliserol atau asilgliserol

Senyawa 3-MCPD terbentuk dengan cara memanaskan campuran natrium klorida dan Tween 80 pada suhu 200 oC. Kadar 3-MCPD meningkat seiring dengan bertambahnya konsentrasi natrium klorida. Pada produk serelia yang dipanggang gliserol bebas merupakan prekursor utama untuk pembentukan 3-MCPD. Gliserol terbentuk akibat penambahan ragi untuk proses pengembangan yang pada proses pemanasan bereaksi dengan natrium klorida sehingga membentuk 3-MCPD.

Stadler et al. (2009).

3-MCPD ester

Pembentukan 3-MCPD secara enzimatis diteliti dengan menggunakan model sistem yang terdiri dari lipase, minyak nabati, natrium klorida dan air. Enzim lipase yang berasal dari Rhizopus oryzae memiliki aktivitas hidrolisis tertinggi terhadap gliserida dari minyak kelapa dan minyak kacang.

Senyawa MCPD dibebaskan dari 3-MCPD ester melalui reaksi hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim lipase yang terjadi di dalam tubuh ataupun pangan

Robert et al. (2004) Zelinkova et al. (2006).

Senyawa 3-MCPD ester terbentuk selama proses pemurnian minyak nabati pada suhu tinggi, terutama pada proses deodorisasi. Mekanisme pembentukan 3-MCPD ester melibatkan ion siklik asiloksonium dari triasilgliserol, diikuti reaksi dengan ion klorida membentuk 3-MCPD ester. Faktor utama pada pembentukan 3-MCPD ester adalah ion klorida, gliserol, tri, di atau monoasilgliserol termasuk suhu dan waktu. Mono dan

8

diasilgliserol dalam minyak nabati memberikan korelasi linier dengan pembentukan 3-MCPD ester (Larsen 2009).

Glisidol ester juga terbentuk selama proses pemurnian minyak nabati, zat ini dikenal sebagai senyawa yang bersifat genotoksik dan karsinogenik, namun belum ada data toksikologi yang mendukung pernyataan tersebut. Glisidol ester dianggap sebagai prekursor pada pembentukan 3-MCPD ester, dengan hadirnya ion klorida (Larsen 2009).

Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan esternya yang berasal dari asilgliserol disajikan pada Gambar 2.2. Menaikkan pH pangan dengan kadar air tinggi, menurunkan suhu pengolahan pangan, mengurangi penggunaan garam dan menurunkan kadar gliserol selama pengolahan dan penyimpanan merupakan cara untuk mengurangi kontaminasi 3-MCPD (Zelinkova et al. 2006).

Senyawa 3-MCPD memberikan efek mutagenik secara in vitro namun tidak secara in vivo. Tikus yang diberi asupan 3-MCPD mengalami toksisitas akut yang memberi efek pada ginjal dan organ reproduksi dengan nilai LD50 sebesar 150 mg/kg berat badan. Pemberian 3-MCPD dengan

dosis > 25 mg/kg berat badan perhari dapat menimbulkan luka pada sistem syaraf pusat tikus dan mencit (WHO 2013). Minimnya data penilaian resiko 3-MCPD ester secara in vivo saat ini maka diasumsi 3-MPCD terbentuk secara sempurna dari pembebasan 3-MCPD ester (Hrncirik 2011).

Gambar 2.2 Pembentukan 3-MCPD dan esternya dari asilgliserol (Svejkovska et al. 2006)

9

Beberapa negara termasuk Indonesia telah pengeluarkan peraturan tentang batasan 3-MCPD dalam pangan, khususnya pada kecap dan acid-HPV, seperti tercantum pada Tabel 2.4 dan Tabel 2.5.

Tabel 2.4 Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di Indonesia Jenis Makanan Batas Maksimum (ppb

atau g/kg) Semua makanan yang mengandung protein nabati

terhidrolisis secara asam (makanan cair)

20 Semua makanan yang mengandung protein nabati

terhidrolisis secara asam (makanan padat)

50 Protein nabati terhidrolisis asam (acid-HPV) 1000

Sumber: BPOM (2009)

Tabel 2.5 Batas cemaran kimia 3-MCPD dalam makanan di beberapa negara

Sumber: Stadler et al. (2009)

2.2 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah yang dilakukan untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah sesuai dengan tujuan pengunaannya atau konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus telah dipenuhi (Eurachem 1998). Validasi metode analisis perlu dilakukan karena tidak semua metode yang telah dikembangkan dapat diaplikasikan dan memenuhi kebutuhan laboratorium pengujian.

Negara Kadar

(mg/kg) Ruang Lingkup Australia/Selandia

Baru

0.2 Kecap, saus tiram Kanada 1 Kecap, saus tiram

Cina 1 Acid-hydrolized vegetable protein Uni Eropa 0.02 Hydrolized vegetable protein dan

kecap (kepadatan 40%)

Korea 0.3 Kecap mengandung Acid-hydrolized vegetable protein

1 Hydrolized vegetable protein

Malaysia 0.02 Pangan cair dengan hydrolized vegetable protein

1 Acid-hydrolized vegetable protein

produk industry Swiss 0.2 Saus gurih

Thailand 1 Hydrolized soybean protein Amarika Serikat 1 Acid-hydrolized vegetable protein

10

Pengujian yang benar dan tepat dilakukan untuk dapat menunjukkan dan menjamin keamanan produk pangan sehingga menjadi sangat penting untuk memilih metode tervalidasi, sesuai dengan regulasi dan memiliki parameter yang jelas. Validasi metode diharapkan untuk dapat memenuhi regulasi yang diterapkan pada produk, negara, dokumentasi serta proses dan persyaratan validasi itu sendiri (AOAC Official Method Apendix E 2005).

Tujuan validasi metode analisis adalah untuk menjamin mutu dan atau untuk mencapai tingkat mutu yang ditetapkan pada suatu produk, menjamin mutu produk agar dapat diterima oleh suatu badan internasional, mengkonfirmasi bahwa metode tersebut sesuai untuk penggunaan yang dimaksud, memenuhi persyaratan akreditasi, memenuhi persyaratan pendaftaran suatu produk dan untuk memenuhi persyaratan metode yang digunakan pada uji profisiensi (SNI 2008).

Parameter yang umum digunakan pada validasi metode analisis adalah; spesifisitas atau kekhasan, akurasi atau kecermatan, linieritas dan rentang kerja, presisi atau keseksamaan, batas deteksi, batas kuantitasi, (Codex Stan 193-1995 2010; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998; ICH 2005).

Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode analisis adalah kemampuan mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifisitas dapat pula ditentukan dengan menggunakan sampel spike kemudian dianalisis dan dibandingkan dengan hasil analisis sampel tanpa bahan tambahan.

Linieritas

Linieritas merupakan hasil penjabaran visual suatu sinyal sebagai fungsi dari konsentrasi analit. Linieritas pada suatu prosedur analisis dapat menunjukkan hasil uji yang berbanding lurus dengan konsentrasi atau jumlah analit dalam sampel. Jika terdapat hubungan antara sinyal dan konsentrasi maka hasil analisis dapat dievaluasi secara statistik, seperti koefisien korelasi yang didapatkan dari persamaan y = bx + a. Penetapan Linieritas secara umum membutuhkan minimal 5 konsentrasi analit.

Rentang kerja

Rentang kerja adalah selang batas antara konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi dari analit. Kisaran biasanya ditentukan dari percobaan dan tergantung pada aplikasi metode analisis. Rentang kerja ditentukan untuk mengkonfirmasikan bahwa metode analisis dapat memenuhi linieritas, akurasi dan presisi ketika diterapkan pada sampel yang mengandung jumlah analit pada kisaran konsentrasi tertentu.

11

Akurasi

Akurasi merupakan suatu kecermatan atau ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dapat ditentukan dengan beberapa cara, yaitu: 1) Metode simulasi (spiked-placebo recovery) yaitu suatu analisis kadar analit dengan cara menambahkan analit tersebut dalam matriks sampel yang dianalisis; 2) Metode penambahan baku (standard addition method). Cara ini dilakukan jika matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali kadar analit yang ditambahkan pada sampel yang sudah atau belum mengandung analit; 3) Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi terhadap sampel yang telah diketahui kadarnya yang dikenal sebagai Standard Reference Materials (SRM). SRM adalah sampel acuan baku yang dikeluarkan oleh badan resmi seperti National Institute of Standards and Technology (NIST); 4) Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang divalidasi terhadap hasil dengan metode standar.

Presisi

Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis individual jika prosedur dilakukan berulang kali terhadap sampel yang homogen. Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV). Presisi dibagi atas 3 macam, yaitu repeatability atau keterulangan, presisi antara dan reprodusibilitas atau ketertiruan.

Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang sama untuk sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang analis pada waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama. Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode di mana sampel-sampel diuji dan dibandingkan, dilakukan oleh analis yang berbeda, menggunakan peralatan berbeda dan pada hari yang berbeda. Presisi antara tidak perlu diuji jika uji reprodusibilitas telah dilakukan. Presisi ketiga yaitu reprodusibilitas merupakan cara yang paling lengkap atau tuntas, karena parameter validasi ini dilakukan oleh beberapa laboratorium. Hasil

reprodusibilitas ini akan memperlihatkan adanya galat acak yang

disebabkan oleh sampel dan laboratorium.

Batas deteksi dan batas kuantitasi

Batas deteksi dan batas kuantitasi atau yang lebih umum disebut limit of detection (LoD) dan limit of quantitation (LoQ) dapat ditentukan dengan beberapa cara. Penentuan LoD dan LoQ untuk metode analisis menggunakan instrumen atau tidak tentu saja berbeda. Beberapa cara penentuan adalah: 1) Berdasarkan evaluasi visual. Metode ini dapat dapat digunakan untuk metode analisis tanpa instrumen, namun adakalanya dapat pula digunakan untuk metode analisis dengan instrumen. LoD dan LoQ ditentukan dengan menganalisis sampel yang telah diketahui konsentrasinya, pengujian dilakukan pada sampel dengan konsentrasi analit serendah mungkin yang masih bisa dideteksi (LoD) dan dikuantitasi secara

12

akurat dan presisi (LoQ); 2) Berdasarkan signal to noise. Cara ini hanya bisa dilakukan pada prosedur analisis yang dapat memperlihatkan baseline noise. Analisis dilakukan dengan membandingkan sinyal dari sampel rendah analit dengan sampel blanko; 3) Berdasarkan deviasi standar dari respon dan slope; 4) Berdasarkan deviasi standar dari blanko; 5) Berdasarkan kurva kalibrasi.

Metode analisis untuk identifikasi 3-MCPD ester dapat secara langsung ataupun tidak langsung dengan kelebihan dan kekurangannya masing-masing. Pada metode tidak langsung, 3-MCPD ditentukan sebagai MCPD bebas, ester dibebaskan menjadi komponen tunggal, kemudian 3-MCPD diderivatisasi dan ditetapkan secara GC-MS (Divinova et al. 2004; Weihaar 2008). Pada metode langsung, ester utama ditentukan langsung secara LC-TOFMS atau LC-MSMS (Haines et al. 2011).

Kelebihan metode analisis tidak langsung diantaranya adalah pengujian menggunakan GC-MS; lebih praktis karena hanya menentukan satu analit; metode yang tersedia lebih beragam; batas deteksi dan batas kuantitasi lebih rendah; hanya menggunakan dua baku pembanding (baku eksternal dan internal) yang dapat mendeteksi semua 3-MCPD ester. Kelemahan metode ini adalah hasil pengukurannya lebih besar dibandingkan menggunakan metode langsung, hal ini disebabkan adanya ion klorida pada saat proses hidrolisis, dan glisidol ester yang diubah menjadi 3-MCPD pada proses preparasi; tidak efektif karena membutuhkan waktu preparasi yang lebih lama. Metode ini hanya dapat digunakan jika 3-MCPD telah dibebaskan dari esternya. Terdapat tiga cara pemisahan, yaitu: 1) hidrolisis basa, dengan menggunakan metoksida, cara ini cepat dan mudah, namun cemaran klorida dan glisidil ester dapat meningkatkan level 3-MCPD ester, 3-MCPD tidak stabil pada saat hidrolisis yang dapat menurunkan sensitifitas metode; 2) hidrolisis enzimatik namun metode ini jarang digunakan; 3) hidrolisis asam, metode ini membutuhkan waktu hidrolisis yang panjang, cemaran klorida dapat meningkatkan level 3-MCPD namun efeknya dapat dikurangi dengan melakukan ekstraksi menggunakan H2O; 3-MCPD saat hidrolisis asam kondisinya lebih stabil

(Pinkston et al. 2012).

2.3 Minyak Sawit

Minyak sawit mentah atau crude palm oil (CPO) dikenal sebagai sumber yang kaya akan antioksidan (tokoferol, tokotrienol, karotenoid, fitosterol, senyawa fenolik) dan fitonutrien yang berguna untuk kesehatan. Namun, CPO terlebih dahulu harus melewati proses pemurnian sebelum digunakan sebagai bahan pangan (Szydlowska-Czerniak et al. 2011)

Asam lemak bebas, air dan trace metal pada CPO dapat menyebabkan rendahnya stabilitas minyak sawit. Selain itu, beberapa komponen menyebabkan aroma yang mengurangi palatabilitasnya. Oleh karena itu, CPO umumnya diolah lagi melalui proses pemurnian/refining kimiawi ataupun fisik. Proses pemurnian kimiawi dan fisik melibatkan aplikasi suhu tinggi pada deodorisasi dan deasidifikasi pada kondisi vakum. Deodorisasi

13

dan deasidifikasi pada pemurnian fisik dilakukan pada suhu 250-270 ºC dengan tekanan 3-5 torr, tahapan ini terlihat pada Gambar 2.3. Penggunaan suhu tinggi ini akan memicu perubahan 3-MCPD ester menjadi 3-MCPD (Greyt 2010). Proses pengolahan minyak sawit yang berpengaruh terhadap pembentukkan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester dijabarkan pada Tabel 2.6.

Gambar 2.3 Tahapan proses refining minyak sawit komersial secara kimiawi dan fisik (Greyt 2010)

Tabel 2.6 Pembentukkan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester pada proses pengolahan minyak goreng sawit

Proses pengolahan minyak goreng sawit

Pembentukan 3-MCPD, 3-MCPD ester dan glisidil ester

Crude oil 3-MCPD terbentuk pada proses refining

(deodorisasi) pada suhu 240-270 °C Degumming

3-MCPD diester sebagian besar terbentuk dari triasilgliserol, sebagian diasilgliserol. Proses pembentukan ini membutuhkan sumber klorida Bleaching

Sumber utama glisidil ester adalah diasilgliserol, proses ini tidak membutuhkan klorida. Triasilgliserol tidak membentuk glisidil ester.

Deodorizing 3-MCPD ester dan glisidil ester terbentuk

hingga 20 mg/kg

14

Kadar 3-MCPD ester pada minyak goreng sawit lebih tinggi dibandingkan dengan minyak nabati yang lainnya, seperti tercantum pada Tabel 2.1.

3

METODE

3.1 Bahan dan Alat

Baku eksternal 3-MCPD dan baku internal 3-MCPD-d5 (Fluka,

Sigma-Aldrich), Phenylboronic acid (PBA) untuk derivatisasi (Sigma-Aldrich), natrium metoksida untuk transesterifikasi (Merck), heksan (Merck), etil asetat (Merck), asam asetat glasial (Merck), natrium klorida (Merck), aseton (Merck), methyl tert-butyl ether (MTBE) (Sigma-Aldrich), dan sampel minyak goreng sawit yang diperoleh dari supermarket dan pasar tradisional_. Instrumen utama yang digunakan untuk analisis adalah GC-MS yang dilengkapi autosampler, instrumen penunjang yang digunakan antara lain penangas air dan vorteks.

3.2 Metode Penelitian

Penelitian ini dibagi dalam 3 tahap kegiatan, yaitu: penentuan modifikasi metode analisis, validasi metode analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit secara GC-MS dan analisis 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.

3.2.1 Penentuan Metode Analisis

Metode analisis yang digunakan adalah metode Weihaar yang dimodifikasi, terdiri dari tiga tahapan yaitu ekstraksi, derivatisasi dan analisis dengan menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS). 3-MCPD dibebaskan dari 3-MCPD ester secara transesterifikasi dengan natrium metoksida dalam metanol, kemudian diderivatisasi dengan PBA, selanjutnya 3-MCPD ditentukan dengan GC-MS. 3-MCPD-d5 digunakan sebagai baku internal.

Modifikasi dilakukan pada penggunaan larutan heksan sebagai pengekstraksi menggantikan isoheksan dan kondisi penggunaan GC-MS Varian 320-MS (lihat parameter penggunaan GC dan MS).

Penyiapan larutan baku

Larutan baku ekstrenal disiapkan dengan menimbang secara seksama lebih kurang 50 mg 3-MCPD, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L. Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 25 mg 3-MCPD-d5, dimasukkan ke dalam

labu tentukur 50 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L. Sejumlah baku eksternal dan internal dari baku antara ditambahkan kedalam sampel minyak goreng sawit hingga didapatkan konsentrasi

16

tertentu. Sampel didiamkan pada suhu ruang minimal dua jam kemudian dilakukan preparasi seperti prosedur penyiapan larutan sampel.

Penyiapan larutan sampel

Preparasi sampel untuk penetapan 3-MCPD ester dilakukan dengan menggunakan 100 mg sampel minyak goreng sawit yang dimasukkan ke dalam tabung kaca 10 mL bertutup ulir, ditambahkan 0.5 mL campuran MTBE dan etil asetat (8:2), baku internal dengan kadar 0.13 mg/L, dicampur dan dibiarkan pada suhu ruang sekurangnya 2 jam, kemudian ditambahkan 1 mL natrium metoksida (0.5 mol/L dalam metanol HPLC grade), divorteks selama 30 detik, kemudian didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit, selanjutnya ditambahkan 3 mL heksan, 0.1 mL asam asetat glasial dan 3 mL natrium klorida (200 g/L), divorteks selama 30 detik. Setelah fase organik campuran tersebut dibuang, pada fase air ditambahkan 3 mL heksan dan kembali fase organik dibuang. Pada fase air ditambahkan 250L reagen penderivat (5 g PBA yang dilarutkan dalam 19 mL aseton dan 1 mL air), tabung ditutup dan panaskan pada suhu 80 oC dalam penangas air selama 20 menit. Setelah didinginkan pada suhu ruang, derivat siklik fenilboronat dari 3-MCPD diekstrak dengan 3 mL heksan (Weihaar et al. 2007). Fase organik dipisahkan dan dianalisis dengan GC-MS sesuai parameter penggunaan. Perlakuan yang sama juga dilakukan untuk penetapan 3-MCPD bebas, namun tanpa penambahan natrium metoksida saat preparasi.

Parameter penggunaan GC

Kondisi

penggunaan Metode Weihaar Metode Modifikasi

GC/MS GC-MS (Thermo Scientific) GC-MS 320-MS (Varians) yang dilengkapi autosampler

Kolom Rtx-5MS 30 m x 0.25 mm ID x 0.25m (Restek, Varian)

Rtx-5MS 30 m x 0.25 mm ID x 0.25m (Restek, Varian)

Suhu injector 250 oC 180 oC Suhu oven 80 oC (1 menit), 300 oC

dengan laju 10 oC/menit (37 menit)

60 oC (1 menit), 90 oC dengan laju 6 o

C/menit (1 menit), 280 oC dengan laju 20 oC/menit (5 menit)

Gas pembawa Helium Helium

Aliran kolom 0.8 mL/menit 1.2 mL/menit Penyuntikan Splitless Rasio split 10 Volume

17

Parameter penggunaan MS

Kondisi penggunaan Metode Weihaar Metode Modifikasi Mode aquisition Selected Ion Monitoring (SIM) Selected Ion Monitoring (SIM) Mode ionisasi Electron impact (EI) Electron impact (EI)

Suhu interface - 280 oC

Suhu ion source - 200 oC

m/z 196, 201 (analisis kuantitatif); 147, 150 (kualifikasi)

147, 150 (analisis kuantitatif); 91, 93, 196, 201 (kualifikasi)

3.2.2 Validasi Metode Analisis

Parameter validasi yang diuji meliputi linieritas dan rentang kerjanya, spesifisitas, presisi, akurasi, batas deteksi dan kuantifikasi. Identifikasi puncak ditentukan dengan melihat waktu retensi, spektrum dan kromatogram sampel spike dengan baku pembanding (Codex Stan 193-1995 2012; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998). Kuantifikasi dilakukan menggunakan kurva baku eksternal dengan delapan konsentrasi dan baku internal dengan konsentrasi tetap yang ditambahkan kedalam sampel (sampel spike).

Penyiapan larutan baku

Larutan baku eksternal disiapkan dengan menimbang secara seksama sejumlah kurang lebih 50 mg 3-MCPD, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan baku induk tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L. Larutan baku internal disiapkan dengan melarutkan 25 mg 3-MCPD-d5,

dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh konsentrasi 0.5 mg/mL atau 500 ppm. Sebanyak 0.5 mL larutan stok tersebut dilarutkan dengan etil asetat dalam labu tentukur 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi 12.5 mg/L, selanjutnya larutan baku antara digunakan untuk pembuatan larutan baku kerja. Larutan baku kerja dibuat dalam satu seri dengan konsentrasi tertentu, dengan cara menambahkan larutan baku antara pada volume yang telah ditetapkan ditambahkan kedalam 100 mg sampel minyak goreng sawit. Sampel didiamkan sekurangnya selama dua jam sebelum dilakukan preparasi dan pengujian seperti prosedur pada (3.3.1).

Parameter validasi

Parameter validasi tergantung pada aplikasi, uji sampel, tujuan dari metode, dan pedoman dalam negeri, internasional atau peraturan yang berlaku. Untuk metode analisis ini parameter validasi yang ditetapkan adalah linieritas, presisi, akurasi, spesifisitas, batas deteksi, dan batas kuantitasi (Codex Stan 193-1995 2012; AOAC Official Method Apendix E 2005; AOAC 2002; Eurachem 1998).

18

 Spesifisitas

Spesifisitasadalah kemampuan metode untuk merespon secara khusus analit yang ditentukan tetapi tidak untuk komponen lain dari matriks, namun hanya sedikit metode yang benar-benar spesifik. Istilah ini lebih sering digunakan untuk menyatakan bahwa parameter spesifisitas menunjukan bahwa metode dapat digunakan untuk menentukan analit secara kuantitatif tanpa adanya gangguan, hal ini dapat dilihat pada kromatogram puncak analit yang terpisah.

 Linieritas

Pada penentuan linieritas digunakan 8 baku eksternal dengan konsentrasi 0.01-0.34g/mL dan baku internal dengan konsentrasi 0.13 mg/L. Linieritas dievaluasi dengan memetakan area daerah puncak yang merupakan rasio dari area baku eksternal dan baku internal terhadap rasio konsentrasi baku eksternal dan baku internal dimana umumnya antara keduanya membentuk hubungan linier yang dinyatakan dengan persamaan regresi dan koefisien korelasi (r).

Persamaan regresi : y = bx + a

y = rasio luas area puncak = luas area puncak baku eksternal (3- MCPD)/luas area puncak baku internal (3-MCPD-d5)

x = rasio konsentrasi = konsentrasi baku eksternal (3-MCPD) /konsentrasi baku internal (3-MCPD-d5)

 Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur dan nilai diterima, nilai benar atau nilai referensi, ditentukan secara rekoveri dengan penambahan baku eksternal pada atau disekitar konsentrasi target, uji dilakukan pada satu konsentrasi dengan tujuh ulangan. Nilai rekoveri ditentukan dengan menggunakan persamaan berikut:

Tabel 3.1 Batas rekoveri rata-rata pada matrik sampel Konsentrasi Batas Rekoveri

100% 98-101%

10% 95-102%

1% 92-105%

0.1% 90-108%

0.01% 85-110%

10 g/g (ppm) 80-115% 0.1 g/g (ppm) 75-120% 10 g/kg (ppb) 70-125%

19

Akurasi dapat diterima jika nilai rekoveri memenuhi batasan yang tercantum seperti pada Tabel 3.1.

 Presisi

Presisi merupakan fungsi dari konsentrasi yang menyatakan kedekatan diantara serangkaian pengukuran beberapa sampel homogen. Presisi dilakukan oleh satu orang analis pada waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama. Presisi diukur terhadap 7 sampel homogen dengan konsentrasi sama atau 7 kali ulangan yang masing-masing diukur 2 kali. Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV).

Standar deviasi (SD) ke 7 sampel tersebut dihitung untuk mendapatkan nila RSD dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

x = kadar tiap ulangan x = rata-rata kadar sampel n = jumlah ulangan

Nilai simpangan baku relatif atau koefisien variasi akan meningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. Horwitz telah melakukan kajian terhadap 3000 hasil analisis yang diambil dari studi kolaboratif AOAC dan memberikan hasil sebagai berikut :

KV = ±2 (1-0,5 log C)

C = konsentrasi yang dinyatakan sebagai fraksi desimal

(misalnya untuk kadar C = 100%, maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1) Hubungan koefisien variasi dan konsentrasi digambarkan sebagai kurva berupa terompet yang dinamakan kurva terompet Horwitz (Gambar 3.1 dan Tabel 3.2).

Nilai koefesian variasi dari percobaan dibandingkan terhadap koefesian variasi yang dihitung dari persamaan terompet Horwitz. Nilai perbandingan tersebut merupakan rasio Horwitz yang disebut HorRat, dengan persamaan sebagai berikut :

HorRat = KVpercobaan/KVperkiraan

20

Sumber : Rivera et al. (2012)

Gambar 3.1 Kurva terompet Horwitz

Tabel 3.2 Nilai koefesien variasi Horwitz pada beberapa konsentrasi analit Konsentrasi analit Koefesian variasi

10% 2.8%

1% 4.0%

0.1% 5.7%

0.01% 8.0%

1 ppm 16%

1 ppb 45%

0.1 ppb 64%

Sumber: Rivera et al. (2012)

Presisi dapat dinyatakan memenuhi persyaratan jika memenuhi nilai koefesien variasi lebih kecil dari nilai 2/3 koefisien Horwizt atau jika nilai HorRat 0.5-2.

 Batas deteksi

Batas deteksi (limit of detection, LoD) adalah kuantitas terkecil dari analit yang memberikan tinggi puncak (sinyal) 3 kali noise. Pengujian dilakukan pada sampel spike dengan konsentrasi minimum yang masih dapat dideteksi dengan 10 ulangan. Nilai LoD ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:

21  Batas kuantitasi

Batas kuantitasi (limit of quantitation, LoQ) adalah kuantitas terkecil dari analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang memenuhi syarat, umumnya memberikan tinggi puncak (sinyal) 10 kali noise. Pengujian dilakukan pada sampel spike dengan konsentrasi minimum yang masih dapat diukur dengan 10 ulangan. Nilai LoQ ditentukan dengan persamaan sebagai berikut:

LoQ = (10 x konsentrasi analit) / (sinyal/noise)

3.2.3 Analisis 3-MCPD dalam Minyak Goreng Sawit Komersial

Analisis 3-MCPD total, 3-MCPD dan 3-MCPD ester atau kadar setelah dilakukan hidrolisis dilakukan dengan menggunakan metode analisis yang telah divalidasi. Pada tahap ini preparasi sampel minyak goreng sawit yang akan dianalisis mengikuti tahapan preparasi seperti pada validasi metode analisis (3.2.1). 3-MCPD ester dihitung sebagai selisih antara kadar 3-MCPD total dengan 3-MCPD. Analisis dilakukan sebanyak 6 ulangan.

Sampel minyak goreng sawit komersial yang didapatkan dari pasar tradisional di daerah Jakarta Pusat dan Depok dianalisis sesuai dengan prosedur metode analisis tervalidasi. Jumlah sampel yang digunakan untuk analisis ini adalah sebanyak 11 sampel yang dilakukan sebanyak 2 ulangan.

Analisis asam lemak bebas

Sebanyak 10 g sampel minyak goreng sawit ditambahkan 50 ml alkohol 95% ke dalam erlenmeyer 150 ml. Erlenmeyer ditempatkan pada penangas air pada suhu 60-65 C selama 10 menit. Setelah itu erlenmeyer yang berisi contoh ditambahkan 3 tetes indikator fenolftalein 1 % lalu dititrasi dengan NaOH 0.1N sampai terlihat warna merah muda permanen (tidak hilang dalam 15 detik). Kemudian dihitung kadar asam lemak bebas dengan mengalikan volume NaOH yang terpakai dengan 0.05, hasilnya dilaporkan sebagai persen asam lemak bebas dari asam oleat (AOAC official method 940.28 2005).

Profil digliserida dan trigliserida

Sampel minyak goreng sawit ditimbang teliti kurang lebih sebanyak 50 mg dan dimasukkan dalam vial kemudian ditambahkan 0.2 ml BSTFA (bis (trimethylsilil) trifluoro acetamide) dan 0.1 ml TMCS (Trimethylchlorosilane) dan 0.1 ml larutan baku internal n-tetradecana kemudian dikocok secara hati-hati dan dipanaskan pada suhu 70 oC selama 20 menit, setelah itu segera diinjeksikan ke GC-MS sebanyak 1 l. Dilakukan juga seperti diatas untuk larutan baku eksternalnya, puncak yang muncul diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi dari baku eksternal. Kromatografi gas yang digunakan dilengkapi dengan split injeksi dan FID dengan kondisi sebagai berikut; suhu kolom awal 50 oC dinaikkan menjadi 180 oC dengan kenaikan 15 oC/menit, kemudian dinaikkan lagi menjadi 230 oC dengan kenaikan 7 oC/menit dan dinaikkan lagi menjadi 380 oC, suhu detektor 390 oC, suhu injektor 390 oC, kecepatan gas pembawa 0.7 ml

22

N2/menit, kecepatan aliran udara 450 ml/menit dan volume injeksi 1 l.

Perhitungan kadar dilakukan dengan terlebih dahulu menentukan faktor respon, kromatogram larutan baku eksternal dibandingkan dengan kromatogram baku internal. Kadar ditentukan dengan menggunakan rumus dibawah (AOCS Official Method Cd 11b-91 2003).

Rx = (mbi/mx) x (Ax/Abi)

Rx = faktor respon dari baku x

mbi = mg baku internal

mx = mg baku

Ax = area puncak baku

Abi = area puncak baku internal.

m’x = (1/Rx) x (m’bi/m’s) x (A’x/A’bi)

m’x = mg % komponen x dalam sampel

Rx = faktor respon dari komponen x dalam sampel

m’bi = mg baku internal dalam sampel

m’s = mg sampel

A’x = area puncak dari komponen dalam sampel

4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penetapan Modifikasi Metode Analisis

Prinsip dasar dari penetapan 3-MCPD ester adalah mengubah 3-MCPD ester menjadi 3-MCPD dengan tahapan sebagai berikut: baku internal ditambahkan kedalam sampel, kemudian dilakukan transesterifikasi dengan natrium metoksida dalam metanol (metanolisis), diikuti dengan netralisasi dan salting out, derivatisasi dengan PBA (Tabel 4.1) yang selanjutnya dianalisis dengan GC-MS.

Isoheksan digunakan sebagai lautan pengekstrasi dan heksan digunakan sebagai pelarut analit yang akan diuji (larutan uji) pada metode Weihaar. Metode modifikasi menggunakan heksan sebagai larutan pengekstraksi dan larutan uji dengan pertimbangan; 1) Secara umum tidak terdapat perbedaan yang mencolok antara isoheksan dan heksan (Tabel 4.2); 2) Heksan lebih umum digunakan sebagai larutan pengekstraksi pada industri minyak nabati; 3) Lebih ekonomis. Selain itu hal yang lebih utama adalah metode analisis ini dipilih berdasarkan kemudahan penerapannya di laboratorium.

Tabel 4.1 Tahapan pengujian dan hasilnya Tahapan analisis Hasil Sampel minyak goreng sawit ditambah

baku internal (3-MCPD-d5)

Baku internal bebas menjadi terikat dengan ester asam lemak, seperti dipalmitoil-3-MCPD-d5.

Transesterifikasi atau metanolisis

Perubahan bentuk baku internal dan analit

Dipalmitoil-3-MCPD-d5 dibebaskan menjadi 3-MCPD-d5 dan dipalmitoil-3-MCPD menjadi 3-dipalmitoil-3-MCPD.

Triasilgliserol dan asilgliserol lainnta diubah menjadi FAME dan gliserol, selanjutnya 3-MCPD ester diubah menjadi 3-MCPD.

Netralisasi dan salting out Menghentikan reaksi pembentukan 3-MCPD

Derivatisasi 3-MCPD menggunakan PBA

Membentuk 4-Chloromethyl-2-phenyl-1,3,2-dioxaborolane

24

Tabel 4.2 Karakteristik isoheksan dan heksan

Karakteristik Isoheksan Heksan

Struktur

Rumus molekul C6H14 C6H14

Berat massa 86.1754 86.1754

Nama sistematik 2-methylpentane Hexane

Titik didih 60.3 °C 68.7°C

Titik leleh -153.7 °C -95.3 °C

Kelarutan 0.02 g/l (20 °C) 0.0095 g/l (20 °C)

Data toksikologi LD50 rat > 2000 mg/kg (oral) LD50 rat 25000 mg/kg (oral) LD50 rabbit > 2000 mg/kg

(dermal)

LD50 rabbit > 2000 mg/kg (dermal)

Penggunaan - Industri minyak - Industri kulit

- Ekstraksi minyak nabati - Pelarut lem

- Pembersih Sumber: Wikipedia (2013)

Tahapan validasi metode diawali dengan uji pendahuluan. Tahapan uji pendahuluan meliputi penetapan larutan pengekstrasi, kondisi GC-MS, waktu retensi 3-MCPD dan 3-MCPD-d5 dan ion m/z yang digunakan untuk analisis

kuantitatif serta dilakukan uji kesesuaian sistem, sedangkan validasi metode parameternya adalah uji spesifisitas, linieritas, akurasi, presisi, batas deteksi (LoD) dan batas kuantitasi (LoQ).

Baku internal adalah baku yang ditambahkan ke dalam matrik sampel dengan jumlah tertentu yang biasanya tetap. Baku internal yang digunakan adalah senyawa yang mudah dibedakan dari analit namun memiliki sifat kimia sama. Metode analisis ini menggunakan isotop MCPD sebagai baku internal yaitu 3-MCPD-d5. Penggunaan isotop diharapkan tidak mempengaruhi matrik sampel dan

proses preparasi sehingga analit yang akan diuji memiliki sifat dan karakter yang sama dengan dengan analit pada sampel.

Penentuan nilai m/z ditentukan dengan detektor spektrum massa menggunakan ion m/z 91,147, 196 untuk 3-MCPD dan ion m/z 93, 150, 201 untuk 3-MCPD-d5 (Svejkovska et al. 2006; Zelinkova et al. 2006; Wehaar

2008). Kromatogram yang dihasilkan diidentifikasi dengan memperhatikan respon spektrum, luas area dan gangguan pada puncak kromatogram. Intensitas spektrum terbesar adalah ion m/z 147 3-MCPD dan ion m/z 150 untuk 3-MCPD-d5, hal ini

menjadi salah satu alasan pemilihan ion tersebut untuk analisis kuantitatif, walaupun spektrum yang biasanya digunakan untuk penentuan kuantitatif adalah spektrum ion dengan berat molekul terbesar (Gambar 4.1).

25

Gambar 4.1 Spektrum massa hasil derivatisasi PBA untuk 3-MCPD-d5 dan

26

Gambar 4.2 Kromatogram TIC derivatisasi 3-MCPD-d5 dan 3-MCPD (A),

3-MCPD-d5 m/z 201 (B), 3-MCPD-d5 m/z 150 (C), 3-MCPD m/z

196 (D), 3-MCPD m/z 147 (E)

Kromatogram TIC (total ion chromatograms) dengan menggunakan mode deteksi scan menghasilkan luas puncak gabungan seluruh spektrum massa yang sebanding dengan konsentrasi analit terukur, namun kromatogram baku internal dan eksternal tidak terpisah sempurna, untuk mengatasinya maka digunakan mode ion selektif (SIM) yang dapat memisahkan puncak kromatogram analit (Gambar 4.2). Selain itu SIM waktu siklusnya lebih pendek dari pada mode deteksi scan, maka analisis kuantitatif lebih optimal dan lebih baik akurasi dan presisinya (HP 1998).

Penentuan ion kuantitasi selain dari spektrumnya dapat pula ditentukan berdasarkan kromatogramnya. Ion yang dipilih adalah ion yang memiliki puncak tanpa interferensi atau ion yang memiliki gangguan sedikit mungkin, serta sensitif yang ditunjukkan oleh luas area puncak. Kromatogram analit dengan konsentrasi yang sama dan rendah ditunjukkan pada Gambar 4.2. Kromatogram 3-MCPD

27

pada ion m/z 91 puncak matriks lebih dominan, pada m/z 196 walaupun puncak matrik tidak tampak namun pada puncak analit terlihat ada gangguan pada kedua sisinya sehingga bagian bawah puncak terlihat lebih lebar dan luas area puncaknya lebih kecil dibandingkan kedua ion yang lain. Berdasarkan spektrum dan kromatogram yang dihasilkan maka ion kuantitaf untuk 3-MCPD yang dipilih adalah ion m/z 147 karena memiliki interferensi paling kecil dan luas area puncaknya besar, sementara pemilihan ion kuantitatif 3-MCPD-d5 ditentukan

hanya berdasarkan besaran luas area puncak, sedangkan gangguan terhadap puncak diabaikan karena pada ketiga kromatogram tidak terlihat adanya gangguan. Ion hasil derivatisasi yang terbentuk untuk masing-masing nilai m/z seperti terlihat pada Tabel 4.3.

Gambar 4.3 Kromatogram ion m/z 91 (7A), 147 (7C), 196 (7E) (3-MCPD) dan ion m/z 93 (7B), 150 (7D), 201 (7F) (3-MCPD-d5)

28

Tabel 4.3 Karakteristik ion (m/z) pada spektrum massa MCPD dan 3-MCPD-d5 terderivatisasi

Berat

Molekul M-(CH2Cl) +

(C7H7) +

3-MCPD 196 147 91

M =

3-MCPD-d5 201 150 93

4.2 Validasi Metode Analisis

Spesifisitas terhadap analit

Uji spesifisitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode analisis dapat menentukan dan mengukur konsentrasi analit dengan adanya komponen-komponen lain dalam sampel. Tahapan preparasi sangat mempengaruhi hasil pengujian, isolasi yang efektif akan menghasilkan analit yang terpisah dari matriksnya. Kromatogram memperlihatkan puncak analit yang terpisah dari puncak-puncak lain sehingga memudahkan identifikasi dan pengukuran, bahkan pada sampel yang mengandung analit dengan kadar rendah (Gambar 4.5).

Linieritas dan rentang kerja pengujian

Linieritas suatu metode analisis dapat menunjukkan hubungan yang proporsional antara respon dan konsentrasi analit pada rentang kerja yang ditunjukkan dengan nilai koefesien korelasi (r) lebih besar dari 0.99 (AOAC 2002). Linieritas dievaluasi dengan memetakan area daerah puncak yang merupakan rasio dari area baku eksternal dan baku internal terhadap rasio konsentrasi baku eksternal dan baku internal dimana umumnya antara keduanya membentuk hubungan linier. Penetapan rentang kerja perlu dilakukan untuk setiap metode kuantitatif, sehingga metode terpilih dapat diterapkan. Hal ini merujuk pada konsentrasi sebenarnya yang diukur dalam larutan uji dan bukan dalam sampel sebenarnya. Dalam rentang kerja yaang telah ditentukan, kemungkinan menghasilkan respon yang memiliki hubungan linear dengan kadar analit (Eurachem 1998).

Delapan konsentrasi baku eksternal yang digunakan 0.008-0.377mg/L dan konsentrasi tetap baku internal sebesar 0.13 mg/Lmembentuk persamaan regresi y = 0.076x + 0.005 dengan koefisien korelasi (r) 0.994 (Gambar 4.4).

Presisi dan akurasi hasil uji

Presisi adalah ukuran dari pengulangan suatu metode analisis yang atau akan digunakan secara berkala dan biasanya dinyatakan sebagai persen koefisien variasi. Uji presisi dapat diterima jika persen koefisien variasi lebih kecil dari dua pertiga koefisien variasi Horwizt atau memenuhi nilai HorRat. Akurasi adalah kedekatan antara hasil pengujian dengan nilai benar.

29

Uji presisi dan akurasi dilakukan pada sampel blanko yang ditambahkan baku eksternal dan internal dengan konsentrasi yang sama yaitu 0.13 mg/L dalam 100 mg sampel dengan tujuh ulangan, seperti pada Tabel 4.4.

Gambar 4.4. Kurva linieritas 3-MCPD dalam blanko sampel minyak goreng sawit

Gambar 4.5 Kromatogram 3-MCPD pada ion m/z 147

Batas deteksi dan batas kuantitasi analit dalam sampel

Batas deteksi merupakan konsentrasi minimum analit yang dapat dideteksi, batas kuantitasi adalah konsentrasi minimum yang dapat ditentukan kuantitasnya dan keduanya memenuhi persyaratan akurasi dan presisi.

30

Tabel 4.4 Nilai LoD dan LoQ dari beberapa jenis bahan pangan

Batas deteksi (LoD) dan kuantitasi (LoQ) pada penelitian ini adalah 0.06 mg/kg dan 0.20 mg/kg sampel minyak goreng sawit, jika dibandingkan dengan beberapa penelitian sebelumnya seperti pada tabel (Tabel 4.4) validasi metode ini menunjukkan hasil yang lebih sensitif.

Hasil validasi yang dipaparkan telah melalui tahapan identifikasi data yaitu kompenen yang digunakan pada analisis memiliki kejelasan sumber, identitas, dan kemurniaan baku. Kinerja validasi ditunjukkan pada pengulangan, rekoveri dan batas pengukuran. Data tersebut memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan untuk masing-masing parameter validasi.

Tabel 4.5 Hasil uji presisi, rekoveri, batas deteksi dan batas kuantitasi

Rerata SD KV (%)

2/3 KV Horwitz

(%)

HorRat Persyaratan

Presisi

(mg/kg) 4.06 0.25 6.16 8.64 0.680

KV<2/3KV Horwitz (Codex 2010)

HorRat 0.5-2.0 (AOAC 2005) Rekoveri

(%) 95.83-113.27 6.26 6.16 - -

10 mg/kg, 80-115% (AOAC 2002) 0.1 mg/kg, 75-120% (AOAC 2002) Batas

deteksi 0.06 (mg/kg) Batas

kuantitasi 0.20 (mg/kg)

Sampel LoD LoQ Referensi

Minyak goreng sawit (3-MCPD)

0.06 mg/kg 0.20 mg/kg Hasil validasi penelitian Minyak goreng sawit

(3-MCPD)

0.25 mg/kg 0.5 mg/kg Razak et al. 2012

Safflower (3-MCPD) 50-150 µg/kg Weiβhaar 2008

Minyak nabati (3-MCPD)

3 µg/kg 9 µg/kg Zelinkova et al. 2006 Virgin oil

(3-MCPD ester)

100 µg/kg 300 µg/kg Zelinkova et al. 2006 HVP (3-MCPD ester) 1.1 mg/kg 3.3 mg/kg Divinova et al. 2004 Produk pangan

(3-MCPD ester)

31

4.3 Analisis 3-MCPD dan Esternya dalam Minyak Goreng Sawit

Metode analisis tervalidasi digunakan untuk menetapkan kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD dalam minyak goreng sawit komersial yang diperoleh dari pasar tradisional, hasilnya tercantum pada Tabel 4.6.

Tabel 4.6 Kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD dalam minyak goreng sawit Kode sampel 3-MCPD total (mg/kg) 3-MCPD (mg/kg)

S1 15.77 3.54

S2 15.99 3.59

S3 16.86 3.79

S4 18.16 3.69

S5 17.99 3.81

S6 16.95 3.92

Rerata 16.96 3.72

SD 0.99 0.14

KV (%) 5.83 3.81

2/3 KV Horwitz (%) 6.97 8.75

Kadar MCPD ester ditentukan berdasarkan selisih MCPD total dan 3-MCPD bebas, yaitu sebesar 13.24 mg/kg pada minyak goreng sawit. Hasil yang berada pada rentang kadar 3-MCPD ester sampel minyak goreng sawit pada uji profisensi EU-JRC dengan kisaran hasil 0.6-18.8 mg/kg dan laboratorium yang memenuhi nilai z score sebanyak 56% (Karasek et al. 2010). Larsen (2009) melaporkan bahwa minyak goreng sawit mengandung 3-MCPD ester dengan kadar 4.5-13 mg/kg.

Keberadaan senyawa 3-MCPD dan esternya dalam pangan dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya suhu, pH, kadar air, gula dan lemak, cara pengolahan dan kondisi penyimpanan (Baer et al. 2010). Pada minyak goreng sawit 3-MCPD dan esternya dapat terbentuk pada saat pengolahan saat degumming dan bleaching, adapun penggunaan klorida selalu dimonitoring selama proses pengolahan.

Analisis 3-MCPD total juga dilakukan terhadap sebelas minyak goreng sawit komersial berbeda merek menunjukkan kadar 3-MCPD total bervariasi antara 13.94-34.52 mg/kg (Tabel 4.7). Hal ini diduga terjadi akibat pengaruh proses pengolahan dan lama waktu penyimpanan minyak goreng sawit. Kadar air yang tinggi dan enzim lipase yang ada dalam minyak goreng sawit selama penyimpanan minyak goreng sawit dapat membentuk asilgliserol, terutama diasilgliserol, yang akan menjadi sumber pembentukan 3-MCPD ester (Karsulinova et al. 2007).

32

Tabel 4.7 Kadar 3-MCPD total, DAG, TAG dan ALB dalam minyak goreng sawit komersial

No Sampel 3-MCPD

total (mg/kg) DAG (%) TAG (%) ALB (%) 1 23.60 5.21 94.80 0.19 2 14.79 5.17 94.83 0.17 3 25.50 5.59 94.34 0.15 4 34.52 7.87 92.13 0.11 5 26.79 5.90 94.10 0.13 6 33.36 5.56 94.44 0.13 7 27.10 6.31 93.69 0.13 8 31.62 6.27 93.72 0.23 9 16.66 5.63 94.37 0.18 10 33.92 6.26 93.74 0.11 11 13.94 3.62 96.38 0.11 Rerata 25.62 5.76 94.23 0.15 SD 7.65 1.03 1.029 0.04

Minyak goreng sawit merupakan salah satu komponen penting dalam proses pengolahan pangan, terutama penggorengan, yang berfungsi sebagai penghantar panas. Selama penggorengan, minyak dipanaskan pada waktu yang lama dengan suhu tinggi dan berada pada kondisi terdapat udara dan air. Situasi dan kondisi ini bisa menjadi pencetus terjadinya reaksi kimia dalam minyak goreng sawit.

Sebelas sampel minyak goreng sawit yang telah diketahui 3-MCPD total juga ditentukan kadar diasilgliserida (DAG), triasilgliserida (TAG) dan kandungan asam lemak bebasnya (ALB). Penentuan ini dilakukan untuk melihat korelasinya dengan kandungan 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit seperti terlihat pada Gambar 4.6.

Gambar 4.6 Hubungan antara diasilgliserida dengan 3-MCPD yang terkandung dalam minyak goreng sawit

33

Diasilgliserida memperlihatkan korelasinya dengan kandungan 3-MCPD total, sampel yang mengandung diasilgliserida tertinggi 7.87% mengandung 3-MCPD total sebanyak 34.517 mg/kg sementara sampel yang mengandung diasilgliserida terendah 3.62% mengandung 3-MCPD total sebanyak 13.937 mg/kg (Tabel 4.7 dan Gambar 4.6). Hasil ini sama dengan penelitian Greyt (2010) yang menyatakan bahwa diasilgliserida memilili korelasi dengan 3-MCPD ester, jika kadar diasilgliserida lebih besar dari 4%, maka kadar 3-MCPD ester umumnya lebih besar dari 5 ppm.

5 SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

Modifikasi metode Weihaar yang dilakukan pada penelitian ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit.

Hasil validasi metode analisis 3-MCPD dalam minyak goreng sawit telah memenuhi kriteria akurasi, presisi, linieritas, dan spesifisitas yang ditunjukkan oleh persamaan linear (r) 0.994, rentang kerja 0.008 sampai 0.377 mg/L, batas deteksi 0.06 mg/kg, batas kuantitasi 0.20 mg/kg, presisi (koevesien variasi (KV)) 6.16%, dan akurasi (persen rekoveri) 95.83-113.27%, dalam 100 mg sampel minyak goreng sawit.

Metode analisis tervalidasi dapat diaplikasikan untuk menentukan kadar 3-MCPD dan esternya pada minyak goreng sawit komersial. Sampel minyak goreng sawit yang dianalisis pada penelitian ini diperoleh kadar 3-MCPD total sebesar 16.96 mg/kg, 3-MCPD sebesar 3.72 mg/kg, sedangkan 3-MCPD ester bisa dihitung berdasarkan selisih antara kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD sebesar 13.24 mg/kg. Sebelas sampel yang diuji berdasarkan metode analisis tervalidasi didapatkan jumlah 3-MCPD total yang diperoleh berkisar antara 13.94-34.52 mg/kg.

Hasil analisis memperlihatkan adanya korelasi antara konsentrasi 3-MCPD dalam sampel dengan kandungan diasilgliserida. Sampel dengan kandungan diasilgliserida tinggi akan memberikan hasil pengujian yang tinggi pula terhadap 3-MCPD, hubungan ini dinyatakan dengan koefesien korelasi sebesar (r) 0.752.

5.2 Saran

Dengan menggunakan metode tervalidasi disarankan untuk dilakukan sampling dan monitoring kadar 3-MCPD dan esternya pada minyak goreng sawit mulai dari bahan baku hingga yang beredar di pasar Indonesia dengan mempertimbangkan faktor daerah distribusi, tempat dan lamanya waktu penyimpanan. Disarankan pula pengembangan dan validasi metode analisis untuk analisis 3-MCPD dan esternya dalam produk pangan lainnya yang mengandung minyak dan lemak. Penetapan batas minimum 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit dan produk pangan lainnya yang mengandung minyak dan lemak dalam suatu regulasi terstandar dan dapat diaplikasikan. Penelitian tentang pengaruh parameter teknologi produksi untuk meminimalkan pembentukan 3-MCPD dan esternya juga perlu dilakukan.

37 Hewlett-Packard. 1998. Basics of LC/MS. A primer. Hewlett-Packard company. Hrncirik K. 2010. 3-MCPD ester formation in vegetable oil refining current state

of knowledge [internet]. [diunduh 2012 Nov 26]. Tersedia pada: http://www.ovid-verband.de/fileadmin/user_upload/ovid-verband.de/

downloads/Unilever_Hrncirik.pdf.

Hrncirik K. 2011. Critical factors of indirect determination of 3-chloropropane-1,2-diol esters. Eur. J. Lipid Sci. Technol. Tersedia pada: www.ejlst.com. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim.

Karasek L, Wenzl T, Ulberth F. 2010. Profisensy test on the determination of 3-MCPD esters in edible oil. Final report. EU-JRC. EUR 24356 EN-2010. Karsulinova L, Folprechtova B, Dolezal M, Dostalova J, Velisek J. 2007.

Analysis of the lipid fractions of coffe creamers, cream aerosol, and bouillon cubes for the their health risk associated constituens. Czech J. Food Sci. 25: 257-264.

Larsen. 2009. 3-MCPD ester in food products. International Life Science Institute [ILSI] Europe Report. Summary report of workshop in Brussels Belgium. Pinkston JD, Iannelli DP, Mertens TR. ―Indirect‖ method for the determination of

3-MCPD ester: Hydrolysis time and recovery considerations for the acid hydrolysis method [internet]. [diunduh 2012 Des 02]. Tersedia dari: http://aocs.files.cms-plus.com/ResourcesPDF/Pinkston%20AOCS%202012.pdf. Razak RAA, Kunton A, Wai LS, Ibrahim NA, Ramli MR, Hussein R, Nesaretnam

K. 2012. Detection and monitoring of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) esters in cooking oil. Food Control. 25: 355-360.

Rivera C, Rodriguez R. Horwitz equation as quality benchmark in ISO/IEC 17025 testing laboratory [internet]. [diunduh 2012 Des 02]. Tersedia dari: http://www.bii.mx/documentos/horwitzCf11.pdf.

Robert MC, Stadler RH. 2004. Model studies on th formation of monochloropropanediols in the presence of lipase. J. Agri Food Chem. 52: 5102-5108.

SNI 19-17025. 2008. Persyaratan umum untuk kompetensi laboratorium pengujian dan laboratorium kalibrasi.

Stadler RH, Lineback DR. 2009. Process-induced food toxicants. Occurrance, formation, mitigation and health risks. A John Wiley & Sons, Incc., Publication. Hoboken, New Jersey.

Sundram K, Sambanthamurthi R, Tan YA. 2003. Palm fruit chemistry and nutrition. Asia Pacific J Clin. 12(3): 335-362.

Svejkovska B, Dolezal M, Velisek J. 2006. Formation and decomposition of 3-chloropropane-1,2-diol esters in models simulating processed foods. Czech J. Food Sci. 24: 172-179.

Svejkovska B, Novotny O, Divinova V, Reblova Z, Dolezal M, Velisek J. 2004. Ester of 3-chloropropane-1,2-diol in foodstuffs. Czech J. Food Sci. 5: 190-196.

38

Syarief R, Halid Y1993. Teknologi Penyimpanan Pangan. Penerbit Arcan, Jakarta.

Szydłowska-Czerniak A, Trokowski K, Karlovits G, Szłyk E. 2011. Effect of refining processes on antioxidant capacity, total contents of phenolics and carotenoids in palm oils. Food Chem. 129: 1187–1192.

Velisek J, Calta P, Hasnip S, Dolezal M. 2003. 3-chloropropane-1,2-diol in models simulating processed foods: precursors and agents causing its decomposition. Czech J. Food Sci. 5: 153-161.

Watkins C. April 2009. Chloroesters in foods: An emerging issue. Inform Magazine. AOCS. Urbana.

Weihaar R. 2008. Determination of Total 3-Chloropropane-1,2-diol (3-MCPD) in Edible Oils by Cleavage of MCPD esters with Sodium Methoxide. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 110:183-186.

Wikipedia. Hexane [internet]. [diacu 2012 Des 02]. Tersedia dari: http://en.wikipedia.org/wiki/Hexane.

Zelinkova Z, Svejlkovska B, Velisek J, Dolezal M. 2006. Fatty acids esters of 3-chloropropane-1,2-diol in edible oils. Food Additives Contaminants. 23: 1290-1298.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pariaman, Sumatera Barat, tanggal 17 Mei 1970 sebagai anak pertama dari empat bersaudara, dari pasangan Ayah Drs. H. Asdisyah dan Ibu Hj. Rosniar Darwis.

Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 7 Pariaman tahun 1983, pendidikan menengah pertama di SMPN 1 Pariaman tahun 1986, dan pendidikan menengah atas di SMUN 1 Pariaman tahun 1989. Selanjutnya pada tahun 1990, penulis melanjutkan program Sarjana pada Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan, Universitas Andalas Padang selesai tahun 1996. Kemudian pada tahun 1997 mengikuti Program Profesi Apoteker pada Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta selesai tahun 1998.

Pada tahun 1999, penulis diterima sebagai Calon Pegawai Negeri Sipil pada Balai Teknik Kesehatan Lingkungan Batam dibawah Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Pada tahun 2002 penulis pindah instansi ke Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia dan ditempatkan di Bidang Pangan Pusat Pengujian Obat dan Makanan sebagai staf pengujian, setelah sepuluh tahun penulis pindah unit kerja ke Pusat Riset Obat dan Makan pada instansi yang sama dan ditugaskan sebagai Kepala Bidang Keamanan Pangan. Selama bekerja pada dua instansi pemerintah diatas, penulis telah mengikuti berbagai pelatihan teknis yang berkaitan dengan tugas baik di dalam maupun di luar negeri.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Hasil pengujian untuk linearitas dan rentang kerja baku pembanding

No konsentrasi mg/L Rasio Area Rasio

3-MCPD 3-MCPD-d5 Konsentrasi BE BI Area

1 0.008 0.133 0.063 79808.5 8899000 0.009

2 0.017 0.133 0.126 124678.5 10235000 0.012

3 0.033 0.133 0.251 215919.5 9397500 0.023

4 0.067 0.133 0.502 417113 10430000 0.040

5 0.134 0.133 1.005 830818 10745000 0.077

6 0.201 0.133 1.507 892982 7027000 0.127

7 0.268 0.133 2.010 1492000 8636000 0.173

8 0.377 0.133 2.826 1737000 8383000 0.207

Intercept 0.005

Slope 0.076

Korelasi 0.994 Keterangan : BE (Baku eksternal), BI (Baku internal)

Lampiran 2 Hasil pengujian rekoveri untuk mendapatkan data akurasi

No

Sampel Sampel + standar

(mg/L) Area Rasio Konsentrasi

sampel + standar

Rekoveri (%)

3-MCPD 3-MCPD

3-MCPD-d5

BE BI Area Konsentrasi

1 - 0.134 0.133 739024 9482000 0.078 0.962 0.128 96.25

2 - 0.134 0.133 830859 9871000 0.084 1.044 0.139 104.43

3 - 0.134 0.133 877994 11010000 0.080 0.986 0.131 98.62

4 - 0.134 0.133 759387 9783000 0.078 0.958 0.128 95.83

5 - 0.134 0.133 704004 8863000 0.079 0.982 0.131 98.21

6 - 0.134 0.133 769788 8468000 0.091 1.133 0.151 113.27

7 - 0.134 0.133 873889 10370000 0.084 1.046 0.139 104.56

Rerata 101.60

SD 6.26

KV (%) 6.16

40

Lampiran 3 Hasil pengujian LoD dan LoQ

No Konsentrasi BE (mg/L) S N Konsentrasi BE x Vol akhir S/N x bobot sampel

1 0.008 2261 81 0.009

2 0.008 1161 122 0.026

3 0.008 874 90 0.026

4 0.008 652 88 0.034

5 0.008 2042 81 0.010

6 0.008 994 54 0.014

7 0.008 1429 83 0.015

8 0.008 783 75 0.024

9 0.008 1108 83 0.019

10 0.008 626 69 0.028

Rerata 0.020

LoD 0.061

LoQ 0.204

Keterangan : BE (Baku eksternal), S (sinyal), N (noise) Lampiran 4 Hasil pengujian untuk data presisi

No Waktu Retensi Area Rasio konsentrasi (mg/L)

Konsentrasi (mg/kg)

BE BI BE BI Area Konsentrasi 3-MCPD-d5 3-MCPD 3-MCPD 1 17.889 17.818 739024 9482000 0.078 0.962 0.133 0.128 3.850

2 17.878 17.807 830859 9871000 0.084 1.044 0.133 0.139 4.177

3 17.880 17.809 877994 11010000 0.080 0.986 0.133 0.131 3.945

4 17.893 17.822 759387 9783000 0.078 0.958 0.133 0.128 3.833

5 17.871 17.797 704004 8863000 0.079 0.982 0.133 0.131 3.928

6 17.880 17.797 769788 8468000 0.091 1.133 0.133 0.151 4.531

7 17.880 17.808 873889 10370000 0.084 1.046 0.133 0.139 4.182

rerata 4.064

SD 0.250

KV (%) 6.163

CV Horwizt (%) 12.956

2/3 CV Horwizt (%) 8.637 Keterangan : BE (Baku eksternal), BI (Baku internal)