Hasil kromatogram yang didapat dari langkah 4c, 4d, dan 4e, diamati waktu retensi, bentuk peak, dan nilai AUC alopurinol lalu dibandingkan antara baku
alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel yang ditambah baku alopurinol.
5. Validasi metode clean up SPE MCX
Validasi dilakukan pada hasil optimasi kapasitas kolom dan volume eluen. Proses validasi dilakukan dengan menghitung akurasi dan presisi. Akurasi
dinyatakan dengan perolehan kembali. Sampel ditambah dengan baku sebanyak 200 µl pada 3 level konsentrasi yaitu 5 µgmL, 15 µgmL, 30 µgmL, dan 100
L, 200
L, dan 300 L dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng dilakukan 5 kali
replikasi. perolehan kembali dihitung dengan menggunakan rumus:
perolehan kembali = x 100
Presisi dinyatakan dengan CV yang menunjukkan persentase penyimpangan data yang terjadi. Koefisien variasi CV dihitung pada setiap
replikasi dengan rumus:
CV = x 100
Langkah kerja yang dilakukan adalah a.
Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih kurang 25 mg baku alopurinol, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan
dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5 dalam metanol hingga tanda.
b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol. Larutan intermediet dibuat dengan
konsentrasi 500
gmL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan
amonium hidroksida 5 dalam metanol hingga tanda. c.
Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah 100 L, 300 L, dan 600
L larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Masing-masing labu ukur diencerkan dengan
amonium hidroksida 5 dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 5 gmL, 15 gmL, dan 30 gmL.
d. Penyiapan sampel dalam matriks jamu
Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform hasil
optimasi ekstraksi cair-cair. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air bagian atas, tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N
hingga pH 2. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa
sehingga hasil penyaringan adalah 4 mL. Sampel ditambah dengan seri larutan baku alopurinol sebanyak 200
L pada konsentrasi 5 gmL, 15 gmL, 30 gmL dan 100 L, 200 L, dan 300
L dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng. SPE dikondisikan dengan
mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest, lalu dilakukan loading ekstrak sampel sesuai dengan hasil optimasi langkah 3b ke dalam kolom SPE.
Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2 dan 2 mL metanol. Selanjutnya dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5 dalam
metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida 5 dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan
menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Diinjeksikan sebanyak 9 µ l untuk adisi 5 µgmL, 20 µl untuk adisi 15 µgmL
dan 21 µl untuk adisi 30 µgmL ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidestamonium hidroksida 0,1
10:90, kecepatan alir 0,5 mLmenit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20
L Sari, 2014. Hasil kromatogram yang didapat, diamati nilai AUC lalu dihitung nilai akurasi dan presisi.
6. Penggunaan kembali SPE MCX
