kecepatan alir 0,5 mLmenit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20
L Sari, 2014. Hasil kromatogram yang didapat, diamati bentuk peak dan nilai AUC untuk mengetahui hasil yang optimal dari
proses optimasi ekstraksi cair-cair.
4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan HPLC
Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan HPLC. Cara yang dilakukan adalah dengan cara
membandingan waktu retensi, bentuk puncak, dan nilai AUC antara baku alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel jamu yang ditambah baku alopurinol
yang bertujuan untuk mengetahui apakah dalam sampel jamu terdapat alopurinol. Langkah kerja yang dilakukan adalah
a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih
kurang 25 mg baku alopurinol, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5 dalam metanol hingga
tanda. b.
Pembuatan larutan intermediet alopurinol. Larutan intermediet dibuat dengan konsentrasi 500
gmL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan
amonium hidroksida 5 dalam metanol hingga tanda. c.
Pembuatan larutan baku alopurinol dengan konsentrasi 30 gmL. Diambil sejumlah 600 L larutan intermediet alopurinol kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 10 mL. Labu ukur diencerkan dengan amonium hidroksida 5 dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 30
gmL.
Larutan baku alopurinol diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidestamonium hidroksida
0,1 10:90, kecepatan alir 0,5 mLmenit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm Sari, 2014.
d. Penyiapan blanko sampel jamu
Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform 3 mL
sebanyak 3x. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air bagian atas, tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N hingga pH 2.
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa sehingga hasil
penyaringan adalah 4 mL. SPE dikondisikan dengan mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL
aquabidest, lalu dilakukan loading ekstrak sampel sebanyak 1000 L ke dalam
kolom SPE. Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2 dan 2 mL metanol. Selanjutnya dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida
5 dalam metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida 5 dalam metanol sebanyak 10 mL lalu
disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Diinjeksikan sebanyak 20 µ l ke dalam HPLC fase terbalik dengan
kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidestamonium hidroksida 0,1 10:90, kecepatan alir 0,5 mLmenit, detektor UV dengan panjang
gelombang 274 nm Sari, 2014.
e. Penyiapan sampel dalam matriks jamu
Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform 3 mL
sebanyak 3x. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air bagian atas, tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N hingga pH 2.
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa sehingga hasil
penyaringan adalah 4 mL. Sampel ditambah dengan seri larutan baku alopurinol sebanyak 200
L pada konsentrasi 5 gmL, 15 gmL, 30 gmL dan 100 L, 200 L, dan 300
L dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng. SPE dikondisikan dengan
mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest, lalu dilakukan loading ekstrak sampel sebanyak 1000
L ke dalam kolom SPE. Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2 dan 2 mL metanol. Selanjutnya
dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5 dalam metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida
5 dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan menggunakan milipore
kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol :
aquabidestamonium hidroksida 0,1 10:90, kecepatan alir 0,5 mLmenit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm Sari, 2014.
Hasil kromatogram yang didapat dari langkah 4c, 4d, dan 4e, diamati waktu retensi, bentuk peak, dan nilai AUC alopurinol lalu dibandingkan antara baku
alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel yang ditambah baku alopurinol.
5. Validasi metode clean up SPE MCX
