1:10 vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat 1M. larutan didiamkan selama OT, absorbansinya diukur pada panjang gelombang
maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. 1:1, reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi RSD,
linearitas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 ml larutan uji 950 µgml, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam
galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per gram fraksi air. Dilakukan tiga kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang maksimum Pada tiga labu ukur 10 ml, dimasukkan masing- masing 0,4; 1,2; dan 2 ml
larutan DPPH 0,4 mM. Tiap labu ukur tersebut ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga didapatkan konsentrasi DPPH sebesar 0,016; 0,048; dan
0,080 mM. Larutan tersebut divortex 30 detik. Larutan kemudian didiamkan selama 30 menit. Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometer
visible pada panjang gelombang antara 400-600 nm.
b. Penentuan operating time OT Sejumlah larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu ukur sebanyak tiga
buah berukuran 5 ml. Kemudian masing-masing labu ukur ditambahkan dengan 1 ml larutan pembanding rutin 5; 15; dan 25 µgml kemudian ditambahkan metanol
p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang hasil
pengukuran selama 1 jam .
Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari larutan uji fraksi air pada konsentrasi 50, 150, dan 250 µgml.
10. Pengujian aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol Pada labu takar 5,0 ml, dimasukkan sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4
mM kemudian ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum.
Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-
masing labu ukur 5,0 ml kemudian ditambah dengan 1,0 ml larutan pembanding 5; 10; 15; 20; 25 μ gml dan larutan uji 50; 100; 150; 200; 250 μ gml. Selanjutnya,
tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter presisi
RSD, linearitas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. d. Prosedur 8 a dan b kemudian dihitung IC dan IC
50
untuk rutin dan fraksi air ekstrak etanolik beras hitam.
F. Analisis Hasil
