Metoda Penelitian Ethical Clearance dan Informed Consent Cara Kerja 1. Pengambilan Sampel

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Metoda Penelitian

Metoda penelitian dilakukan secara potong lintang. 3.2.Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik dan bekerja sama dengan Departemen NeurologiFakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara RSUP Haji Adam Malik Medan. Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2013 sampai dengan Oktober 2013. Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan. 3.3.Populasi dan SampelPenelitian Populasi terjangkau penelitian ini adalah pasiendengan gejala klinik stroke iskemik akutyang datang di instalasi gawat daruratRSUP Haji Adam Malik Medan mulai bulan Agustus-Oktober 2013. 3.4. Sampel Penelitian 3.4.1. Cara Pengambilan Sampel Penelitian Pengambilan sampel dilakukan secara konsekutif terhadap semua populasi terjangkau yang memenuhi kriteria penelitian. Ubiversitas Sumatera Utara

3.4.2. Besar Sampel

52,53 Untuk uji diagnostik digunakan rumus besar sampel untuk uji hipotesa dengan populasi tunggal : n ≥ �� 1 −∝ 2 ���1−��+� 1 −� ��� 1−�� � 2 ��−�� 2 � 1 − ∝ 2 = Deviatbaku Alpha untuk α = 0,05 1,96 � 1 −� = Deviatbaku Beta untuk β = 0,10 1,282 Po = Proporsi Stroke IskemikAkut = 0,43 6 Po – Pa = Beda proporsi yang bermakna di tetapkansebesar = 0,25 Pa = Perkiraanproporsistrokeiskemikakut yang diteliti = 0,68 n = Besar sampel = 40 3.5. Kriteria Penelitian 3.5.1. Kriteria Inklusi 1. Penderita yang secara klinis terbukti menderita stroke iskemik akut selama 1 minggu. 2. Bersedia ikut dalam penelitian.

3.5.2. Kriteria Eksklusi

1. Mendapatkan terapi antikoagulant trombolisis 2. Sepsis 3. Koma Ubiversitas Sumatera Utara

3.6. Ethical Clearance dan Informed Consent

Ethical Clearance diperoleh dari Komite Penelitian Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dengan Nomor: 270KOMETFK USU Informed Concent diminta secara tertulis dari subjek penelitian atau diwakili oleh keluarganya yang ikut bersedia dalam penelitian setelah mendapat penjelasan mengenai maksud dan tujuan penelitian. 3.7. Cara Kerja 3.7.1. Pengambilan Sampel 1. Data penderita dikumpulkan dari catatan medik dan anamnesis. Pengumpulan data dimulai dari pengumpulan data penderita dengan gejala klinik stroke iskemik akut berdasarkan kriteria siriraj strokescore, yang masuk ke instalasi gawat darurat 2. Dilakukan anamnesis, pemeriksaan fisik dan pengambilan sampel darah sebelum dilakukan CT scan 3. Dilakukan tindakan flebotomi dari vena mediana cubiti sebanyak 3cc dan dimasukkan ke dalam vacutainerBD Vacutainer berisi natrium sitrat 3,2, kadar 0,109 M 9:1. Tempat pungsi vena terlebih dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering sebelum dilakukan pungsi 4. Sampel darah yang didapat disentrifugasi 3500 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan supernatan, kemudian diperiksa kadar D-dimer dengan alat Dimex Jr, menggunakan metoda latex agglutination, tehnik immunoturbidimetri, dengan satuan ngml Ubiversitas Sumatera Utara 5. Bila hasil CT scan didapatkan lesi atau gambaran infark pada jaringan otak, maka dianggap menderita stroke iskemik, sedangkan bila hasil CT scan tidak didapatkan lesi infark maka dianggap bukan stroke iskemik 6. Dilakukan pengolahan data dan uji diagnostik dari hasil yang didapatkan 3.7.2.Pemeriksaan Kadar D-dimer 3.7.2.1. Pra Analitik Pasien : Tidak ada persiapan khusus Sampel : • Gunakan sampel plasma sitrat 3,2 • Tabung penampung plasma sitrat harus terbuat dari plastik dan bertutup rapat centrifuge tube. • Segera lakukan pemeriksaan, bila ditunda hanya dalam batas waktu ± 2 jam setelah pengambilan pada suhu kamar

3.7.2.2. Analitik

Cara Kerja Darah sitrat dengan perbandingan 9 : 1 segera di sentrifugasi selama 15 menit, dengan kecepatan 3500 rpm. Pemeriksaan dilakukan berdasarkan metoda latex agglutination dengan alat Dimex Jr. Metoda : latex agglutination Prinsip : immunoturbidimetri Bahan : plasma sitrat Reagensia • Latex suspension 0,3 • Reaction buffer • Saline solution Ubiversitas Sumatera Utara Cara kerja : 1. Masukkan 25 μl plasma ke dalam kuvet 2. Tambahkan 100 μl Reaction Buffer 3. Inkubasi selama 1 menit 4. Pindahkan kuvet ke “optic”, dan aktifkan “optic” 5. Masukkan 50 μl Latex yang sudah diinkubasi, kemudian aduk homogen. Alat akan start otomatis dan hasil akan terbaca secara otomatis Gambar 3. 1 Cara Pemeriksaan D-dimer Dikutip dari : Petunjuk Dimex Jr 50

3.7.2.3. Pasca Analitik

Interpretasi Hasil pemeriksaan kadar D-dimer secara kuantitatif dinyatakan dalam satuan ngml, dengan nilai cut off500 ngml. 27 Kadar D-dimer yang lebih dari nilai normal rujukan menunjukkan adanya produk degradasi fibrin dalam kadar yang tinggi, mempunyai arti adanya pembentukan dan pemecahan trombus dalam tubuh. Kadar Ubiversitas Sumatera Utara D-dimer yang normal dapat digunakan untuk menyingkirkan diagnosis banding gangguan pembekuan darah sebagai penyebab dari gejala klinik yang ada. 3.7.3.Prosedur Kalibrasi Pemeriksaan Kadar D-dimer 1. Nyalakan alat Dimex Jr, tunggu alat stabil dan lampu hijau menyala kemudian pilih parameter pemeriksaan DD D-dimer 2. Cek dan set ke default kurva kalibrasi DD pada alat Dimex Jr Default adalah sebagai berikut Standard mOD 1600 ngml 219 mOD 200 ngml 28 mOD 3. Inkubasi Latex selama 30 menit pada suhu 37°C pada inkubator reagen Dimex Jr 4. Larutkan TECal DD, TEControl DD low dan TEControl DD high dengan menggunakan aquabidest 1 ml 5. Diamkan hingga larut sempurna selama 5 menit, kemudian homogenkan di atas mixer roller selama 10 menit hingga homogen, kemudian diamkan selama 5 menit pada temperatur ruangan 6. Lakukan pengenceran terhadap TECal DD dengan menggunakan IBS buffer sebagai berikut Konsentrasi Te Cal IBS Buffer Cal 1 1500 ngml 200 µl 200 µl Cal 2 1 ng - - Ubiversitas Sumatera Utara 7. Pipet 25 μl standar ke dalam kuvet dan tambahkan 100 μl Reaction Buffer, kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu 37°C. Sesudah 2 menit, pindahkan kuvet ke “optic” dan tekan tanda “optic” Pada display 8. Tambahkan 50 μl Latex yang sudah diinkubasi ke dalam kuvet tersebut kemudian mix 3-5 kali secara perlahan, teratur dan mantap tanpa menimbulkan busa. 9. Lakukan minimal duplo 10. Catat nilai mOD optical density yang di dapat dari pemeriksaan D- dimer.Ambil nilai rata-rata mOD dari masing-masing pengenceran tersebut 11. Cara memasukan hasil standar kalibrasi pada kertas grafik : a. Siapkan kertas grafik linear dan masukan nilai rata-rata mOD pada sumbu Y dan konsentrasi pengenceran pada sumbu X. Masukkan nilai rata-rata mOD sesuai konsentrasi masing-masing pengenceran b. Kemudian tariklah garis untuk menghubungkan satu titik dengan titik yang lain. Jika garis yang terbentuk linear maka nilai rata-rata duplo yang di dapat boleh dimasukan ke dalam memori alat. Jika garis yang dihasilkan tidak linear, maka pengujian harus di ulang hingga mendapatkan garis yang linear. Ubiversitas Sumatera Utara Grafik 3.1 Grafik Kalibrasi D-dimer 12. Cara memasukkan data standar kalibrasi yang baru pada alat a. Dari parameter DD tekan “MENU” b. Masukkan nilai konsentrasi ngml standar 1599 c. Ambil nilai rata-rata mOD yang di dapat dari pengenceran standar 1599 kemudian masukkan nilai rata-rata mOD yang didapat ke memori DD alat Dimex Jr 219 d. Masukkan nilai konsentrasi ngml standar 1 e. Masukkan ke dalam memori alat Dimex Jr nilai mOD untuk konsentrasi 1 ngml = 1 mOD 13. Kerjakan kontrol low dan high untuk membuktikan kurva kalibrasi yang baru. Nilai kontrol harus masuk dalam kontrol range yang tertera pada kit insert Dimex Jr. 50 100 150 200 250 500 1000 1500 2000 ab so rb an ce m O D Concentration ngml Series1 Linear Series1 Ubiversitas Sumatera Utara 3.7.4.Pemantapan Mutu Pemantapan mutu dilakukan untuk menjamin dan mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Sebelum dilakukan pemeriksaan terlebih dahulu dilakukan kalibrasi alat.

3.7.4.1. Kalibrasi Pemeriksaan Laboratorium

Kalibrasi pemeriksaan D-dimer dilakukan dengan menggunakan TECALDD dengan Lot.No 98201720. Kalibrasi dilakukan setiap pemakaian reagen baru. Tabel 3.1 Hasil Kalibrasi D-dimer Kalibrator Konsentrasingml AbsorbansimOD CAL 1 1599 218 CAL 2 1599 220

3.7.4.2. Kontrol Kualitas Pemeriksaan D-dimer

Kontrol kualitas pemeriksaan D-dimer menggunakan TEControl DDHigh dengan Lot.No 97001721, TEControl DD Low dengan Lot.No 97011722. Nilai konsentrasi kontrol harus masuk dalam range yang ditetapkan untuk menjamin akurasi pemeriksaan D-dimer. Tabel 3.2 Hasil KontrolKualitas D-dimer No Tanggal Pemeriksaan Kelompok Pemeriksaan Kontrol High ngml Nilai Target ngml Kontrol Low ngml Nilai Target ngml

1. 02-08-2013

N= 8 778 726-1210 260 235-436

2. 15-08-2013

N= 6 810 726-1210 310 235-436

3. 04-09-2013

N= 10 800 726-1210 360 235-436

4. 5.

19-09-2013 04-10-2013 N=8 N= 8 810 796 726-1210 726-1210 425 400 235-436 235-436 Ubiversitas Sumatera Utara