17
2.7 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang akan digunakan adalah 220 ekor ikan nila mempunyai ukuran panjang tubuh 5,48 ± 0,04 cm. Sebelum pengujian, hewan
percobaan diaklimasi terlebih dahulu selama 7-14 hari dengan tujuan menyeragamkan makanan dan hidupnya dengan kondisi yang sama serta
menghilangkan stres akibat transportasi sehingga dianggap memenuhi syarat untuk penelitian.
Dua minggu sebelum pengujian dilakukan, hewan percobaan harus dipelihara dan dirawat dengan sebaik-baiknya pada akuarium yang mempunyai
ventilasi baik dan selalu dijaga kebersihannya. hewan yang sehat ditandai dengan gerakan yang lincah Ditjen POM, 1979.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan
3.3.1 Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Pengambilan dan pengolahan sampel telah dilakukan oleh Frans Apandi 2014 dalam penelitian uji aktivitas antihipertensi ekstrak etanol daun legundi
Vitex trifolia L. pada tikus hipertensi yang diinduksi dengan epinefrin. Pada penelitian ini digunakan tumbuhan yang sama sehingga pengambilan dan
pengolahan sampel tidak dilakukan kembali.
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Legundi EEDL
Pembuatan ekstrak etanol daun legundi dilakukan secara perkolasi dengan pelarut etanol 96 Ditjen POM, 1979. Pembuatan ekstrak telah dilakukan oleh
Frans Apandi 2014 dalam penelitian uji aktivitas antihipertensi ekstrak etanol daun legundi Vitex trifolia L. pada tikus hipertensi yang diinduksi dengan
Universitas Sumatera Utara
18
epinefrin. Pada penelitian ini digunakan tumbuhan yang sama sehingga pembuatan ekstrak tidak dilakukan kembali. Cara pembuatan: Sebanyak 500 g
serbuk daun legundi dan 3 L etanol. Dimasukkan ke dalam bejana tertutup selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali
ditekan hati-hati, tuangi dengan etanol secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan etanol, tutup perkolator, biarkan
selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang-ulang etanol secukupnya sehingga selalu terdapat selapis
cairan etanol diatas simplisia, hingga diperoleh 80 bagian perkolat. Peras massa, campurkan cairan perasan ke dalam perkolat, tambahkan etanol secukupnya
hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana, tutup, biarkan selama 2 hari ditempat sejuk, terlindung cahaya, kemudian disaring Ditjen POM, 1979.
Seluruh perkolat digabung dan dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental.
3.4 Tahap Pengujian
3.4.1 Uji Pendahuluan
Percobaan pada tahap pendahuluan ini bertujuan untuk mencari kisaran konsentrasi krisis bahan uji yang akan digunakan untuk uji toksistias LC
50
. Hewan uji sebanyak 7 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari 10 ekor ikan dan
dimasukkan ke dalam akuarium yang berisi 10 L air tawar dengan konsentrasi bahan uji adalah: 0,1; 1; 10; 100; 1000; 10000 ppm ditambah kontrol 0 ppm.
Selama percobaan berlangsung hewan uji diberi makan. Pengamatan dilakukan pada hari ke-1, 2, 3, 4, 5, 6 dan yang mati dicatat. Hewan uji yang mati pada
Universitas Sumatera Utara
19
waktu pengamatan segera dikeluarkan dari media uji untuk menghindari kemungkinan perubahan kualitas air yang bukan disebabkan oleh bahan uji.
Hewan uji diamati tiap konsentrasi dan dihitung secara kumulatif dalam tiap hari. Amati pula tingkah laku hewan uji dalam wadah yang diberi perlakuan
Rumampuk dkk., 2010.
Tabel 3.1 Konsentrasi Uji Pendahuluan.
Kelompok Jumlah Ikan
Konsentrasi ppm Kontrol
10 P1
10 0,1
P2 10
1 P3
10 10
P4 10
100 P5
10 1000
P6 10
10000 Keterangan :
a. kelompok kontrol : diberi air tawar
b. kelompok perlakuan P1 : diberi EEDL konsentrasi 0,1 ppm
c. kelompok perlakuan P2 : diberi EEDL konsentrasi 1 ppm
d. kelompok perlakuan P3 : diberi EEDL konsentrasi 10 ppm
e. kelompok perlakuan P4 : diberi EEDL konsentrasi 100 ppm
f. kelompok perlakuan P5 : diberi EEDL konsentrasi 1000 ppm
g. kelompok perlakuan P6 : diberi EEDL konsentrasi 10000 ppm
Setelah diberikan bahan uji kemudian diamati gejala toksik dan dilihat jumlah kematian hewan. Kemudian ditentukan konsentrasi yang akan digunakan
sebagai acuan untuk melakukan uji LC
50
. 3.4.2
Uji LC
50
Setelah kisaran konsentrasi krisis ekstrak etanol daun legundi diketahui, maka dipilih empat konsentrasi yang berbeda, yaitu : 5; 50; 500 dan 5000 ppm
ditambah kontrol 0 ppm. Kelima konsentrasi tersebut selanjutnya digunakan dalam penentuan LC
50
Abel, 1991; Dinnel, 1994.
Universitas Sumatera Utara
20
Hewan uji sebanyak 10 ekor dimasukkan ke dalam setiap wadah percobaan 5 wadah uji yang berisi 10 L air tawar dan bahan uji dengan
konsentrasi yang telah ditentukan, setiap perlakuan dilakukan tiga kali pengulangan. Pengamatan dilakukan pada hari ke-1, 2, 3, 4, 5, 6 dan hewan yang
mati dicatat. Hewan uji diamati pada tiap konsentrasi dan dihitung secara kumulatif.
Tabel 3.2 Konsentrasi Uji LC
50.
Kelompok Jumlah Ikan
Konsentrasi ppm Kontrol
10 P1
10 5
P2 10
50 P3
10 500
P4 10
5000 Keterangan :
a. kelompok kontrol : diberi air tawar
b. kelompok perlakuan P1 : diberi EEDL konsentrasi 5 ppm
c. kelompok perlakuan P2 : diberi EEDL konsentrasi 50 ppm
d. kelompok perlakuan P3 : diberi EEDL konsentrasi 500 ppm
e. kelompok perlakuan P4 : diberi EEDL konsentrasi 5000 ppm
3.4.3 Pengamatan
Pengamatan terhadap hewan uji dilakukan selama 6 hari dengan pengulangan sebanyak 3 kali. Pengamatan yang dilakukan adalah gejala toksik
dan kematian hewan uji.
3.4.3.1 Gejala Toksik
Gejala toksik pada ikan meliputi ikan mulai gelisah ditandai dengan gerakan tubuh yang tidak teratur dan bernafas dengan cepat, hilangnya
kesensitifan dimana ikan diam di dasar dan pergerakan sirip berkurang, penurunan keaktifan dimana ikan tidak respon terhadap cahaya dan sentuhan serta kondisinya
lemah, hilangnya keseimbangan ditandai sirip lumpuh, kemampuan bergerak dan
Universitas Sumatera Utara
21
melihat hilang serta hilangnya kesadaran, kehilangan keseimbangan secara total ditandai dengan gerakan ikan yang tiba-tiba berposisi diagonal dengan kepala
langsung mengarah ke permukaan, fase kematian dimana ikan mati karena kelumpuhan organ pernafasan dan tahap terakhir adalah rigor mortis yang
ditandai dengan pengerasan seluruh tubuh dan sirip Metelev, dkk., 1983.
3.4.3.2 Kematian Hewan
Ikan nila diamati kematiannya dari hari pertama sampai hari terakhir. Pengamatan kematian hewan dianalisis statistik dengan uji One Sample T-Test
pada program Statistic Product and Service Solutions SPSS versi 17.0.
3.4.3.3 Analisis Data
Data dianalisis dengan uji One Sample T-Test untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan. Analisis statistik ini menggunakan program SPSS
Statistical Product and Service Solution versi 17.0 dengan taraf kepercayaan 95.
Universitas Sumatera Utara
22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Bahan Baku Ekstrak
Pada penelitiaan ini digunakan ekstrak etanol daun legundi yang sama dengan ekstrak yang digunakan Frans Apandi 2014 pada penelitian yang
berjudul uji aktivitas antihipertensi ekstrak etanol daun legundi Vitex trifolia L. pada tikus hipertensi yang diinduksi dengan epinefrin. Oleh karena itu,
identifikasi, skrining fitokimia sampel dan karakterisasi tidak dilakukan lagi. Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Pusat Penelitian dan
Pengembangan LIPI Bogor, menunjukkan bahwa tumbuhan yang diteliti adalah Vitex trifolia L., famili Lamiacea Apandi, 2014.
Ekstrak etanol daun legundi EEDL disimpan di dalam lemari pendingin dalam wadah tertutup rapat sehingga EEDL terhindar dari kontaminasi zat-zat
asing. Penyimpanan di dalam lemari pendingin bertujuan untuk mencegah tumbuhnya jamur. EEDL yang digunakan berwarna hijau kelabu, bau aromatik
khas, rasa pahit Apandi, 2014. Hasil karakterisasi dan skrining fitokimia simplisia daun legundi, dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 32.
4.2 Hasil Uji Pendahuluan
Hasil uji pendahuluan pemberian ekstrak etanol daun legundi EEDL dilakukan selama 6 hari ditemukan adanya kematian pada ikan uji pada
konsentrasi 100 ppm, 1000 ppm dan 10000 ppm dengan ditandai gejala toksik yang dialami ikan uji. Hasil uji pendahuluan dapat dilihat seperti berikut:
Universitas Sumatera Utara
23
Tabel 4.1 Hasil Uji Pendahuluan Pemberian Ekstrak Etanol Daun Legundi
pada Ikan Nila. Kelompok
Jumlah ikan yang mati Kontrol
- 0,1 ppm
- 1 ppm
- 10 ppm
- 100 ppm
2 ekor 1000 ppm
5 ekor 10000 ppm
10 ekor Pada uji pendahuluan yang dilakukan selama 6 hari terlihat bahwa adanya
kematian pada ikan nila pada kelompok konsentrasi 100 ppm sebanyak 2 ekor, 1000 ppm mengalami kematian ikan nila sebanyak 5 ekor dan 10000 ppm
mengalami kematian ikan nila sebanyak 10 ekor.
4.3 Hasil Uji LC