selama 5 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada λ 595 nm. Larutan
standar diberi perlakuan yang sama dengan larutan sampel dengan konsentrasi 0,1 – 1,0 mgml. Tabel komposisi volume larutan dalam pembuatan larutan standar
konsentrasi 0,1 – 1,0 mgml dari larutan stok BSA konsentrasi 2 mgml disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0,1 – 1,0 mgml Konsentrasi BSA mgml
Volume BSA ml Volume akuades ml
0,1 0,05 0,95
0,2 0,10 0,90
0,3 0,15 0,85
0,4 0,20 0,80
0,5 0,25 0,75
0,6 0,30 0,70
0,7 0,35 0,65
0,8 0,40 0,60
0,9 0,45 0,55
1,0 0,50 0,50
3.4.3 Analisis asam amino AOAC 1995
Pengukuran asam amino dilakukan dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography
HPLC. Tahapan meliputi hidrolisis, derivatisasi, dan injeksi. Tahap hidrolisis, sampel ditimbang sebanyak 0,25 – 0,50
gram kemudian dimasukkan ke dalam tabung 25 ml, setelah itu ditambahkan HCl 6N sebanyak 5 – 10 ml dan dipanaskan selama 24 jam pada suhu 100
o
C
kemudian disaring.
Tahap derivatisasi, sampel diambil 30 ml dan ditambahkan larutan pengering berupa metanol, picolotiocianat, dan triethylamine, setelah itu
dikeringkan atau divakumkan. Proses selanjutnya ditambahkan 30 ml larutan derivatisasi berupa metanol, picolotiocianat, dan triethylamine, lalu didiamkan
selama 20 menit kemudian ditambahkan bufer 20 ml natrium asetat 1 M. Tahap akhir adalah diinjeksikan ke alat. Larutan standar yang digunakan adalah asam
amino standar asam amino murni. Kondisi alat yang digunakan adalah sebagai berikut
: Temperatur
= suhu ruang
Kolom = Pico tag 3,9 x 150 nm
Kecepatan alir = 1,5 mlmenit
Batas tekanan = 3000 Psi
Program = gradien
Fase gerak = asetonitril 60
buffer natrium asetat 1M Detektor
= UV Panjang Gelombang = 254 nm
Perhitungan :
Fk BM
sampel bobot
standar i
konsentras standar
area luas
contoh area
luas mgg
amino asam
x x
x =
Kadar
3.4.4
Analisis proksimat
a Kadar air Apriyantono et al. 1989 Cawan porselen kosong dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C selama 12 jam. Kemudian cawan tersebut didinginkan dalam desikator dan ditimbang
beratnya A gram. Selanjutnya cawan tersebut diisi sampel dan ditimbang B gram. Cawan berisi sampel dimasukkan dalam oven pada suhu 105
o
C sampai beratnya konstan kurang lebih 16 jam, kemudian didinginkan dalam desikator
dan setelah dingin ditimbang C gram. Kadar air dapat dihitung dengan persamaan :
100 x
A B
C B
air Kadar
− −
=
b Kadar abu Apriyantono et al. 1989 Analisis kadar abu dilakukan dengan cara : cawan porselen kosong
dipanaskan dalam oven tanur pengabuan selama 30 menit pada suhu 400
o
C. Kemudian didinginkan dalam desikator, seteleh dingin ditimbang beratnya A
gram. Dilanjutkan penimbangan sampel dan cawan bersama-sama B gram, kemudian dimasukkan dalam tanur pengabuan sampai beratnya tetap warna
keabu-abuan. Pengabuan dilakukan dua tahap. Tahap pertama pada suhu 400
o
C, dilanjutkan suhu 550
o
C sampai bebas dari arang. Setelah itu sampel dan cawan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang beratnya C gram.
Kadar abu dihitung dengan persamaan :
x100 A
B A
C abu
Kadar −
− =
c Kadar protein Apriyantono et al. 1989 Sampel ditimbang sebanyak 2 g dan dimasukkan dalam labu Kjeldahl 100
ml, dan ditambahkan 2 buah tablet Kjeldahl, kemudian ditambah 15 ml H
2
SO
4
lalu didestruksi selama ± 30 menit sampai diperoleh cairan hijau jernih. Cairan didinginkan, kemudian ditambah akuades 5 ml dan dipindahkan ke tabung
destilasi dengan hati-hati, lalu dibilas lagi dengan akuades 5-10 ml. Selanjutnya ke dalam tabung destilasi ditambahkan 10-12 ml NaOH 60 gram NaOH + 5 g
Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O dalam 100 ml akuades sampai cairan berwarna coklat kehitaman. Hasil destilasi ditampung dengan gelas erlenmeyer 125 ml yang berisi 10 ml
larutan H
3
BO
3
dan 2-3 tetes indikator campuran metil merah dan metil biru. Hasil destilasi ini kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai terjadi
perubahan warna menjadi abu-abu. Larutan blanko juga dibuat tanpa menggunakan sampel.
Kadar protein dapat dihitung dengan rumus : 100
mg sampel
berat 4,007
x1 HCl
N x
blanko HCl
ml sampel
HCl ml
N x
− =
Protein = N x 6,25
d Kadar lemak Apriyantono et al. 1989 Labu lemak dikeringkan dalam oven, kemudian didinginkan dalam
desikator dan ditimbang W
1
. Sampel ditimbang 5 g W
2
dimasukkan dalam kertas saring kemudian ditutup dengan kapas. Kertas saring berisi sampel tersebut
kemudian dimasukkan dalam alat ekstrak soxhlet lalu dipasang alat kondensor di atasnya dan labu lemak di bawahnya. Pelarut dietil eter dituangkan ke dalam labu
lemak secukupnya. Refluks dilakukan minimal 5 jam sampai pelarut turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Destilasi pelarut yang ada dalam labu
lemak ditampung pelarutnya. Selanjutnya labu lemak yang berisi hasil ekstrasi dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C. Setelah dikeringkan sampai berat
tetap, kemudian didinginkan dalam desikator, labu lemak ditimbang kembali W
3
. Berat lemak dihitung dengan rumus : x100
g W
g W
W lemak
Kadar
2 1
3
− =
e Kadar karbohidrat Karbohidrat dihitung by difference dengan persamaan :
Karbohidrat = 100 - kadar abu + kadar air + kadar protein + kadar lemak
3.5 Rancangan Percobaan
