Variabel Penelitian Definisi Operasional Ekstrak Pasta CaOH Analisis Data

h. Kontrol media  media RPMI + ekstrak 0,78  3 sampel i. Kontrol media Blanko  RPMI  3 sampel sebagai kontrol CaOH 2. Jadi, jumlah keseluruhan sampel adalah 111 sampel.

4.3 Variabel Penelitian

4.4 Definisi Operasional

4.4.1 Ekstrak A.vera adalah ekstrak yang diperoleh dengan melakukan ekstraksi A.vera kering dengan pelarut etanol 96 sehingga diperoleh ekstrak kental. Variabel bebas

a. Ekstrak

A.vera

b. Pasta CaOH

2 Variabel tergantung Sitotoksisitas terhadap sel fibroblas kultur cell lines BHK-21 Variabel tidak terkendali a. Perlakuan terhadap A.vera selama tumbuh b. Lingkungan kondisi tanah dan iklim tempat tumbuh A.vera c. Suhu pengiriman bahan coba Variabel terkendali a. Jenis dan asal tumbuhan A.vera Aloe barbadensis Miller, Marelan b. Periode pemanenan A. vera 12 bulan c. Cara pengambilan pelepah A. vera dari pangkal pelepah berwarna putih d. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media e. Freeze dryer dengan tekanan 2 atm, suhu -30 C, dan waktu pengeringan 48 jam f. Pelarut etanol destilasi 96 g. Suhu 40 C penguapan dengan rotavapor h. Media pertumbuhan sel fibroblas RPMI- 1640 i. Stem sel fibroblas kultur cell lines BHK-21 j. Suhu inkubasi uji sitotoksisitas 37 C dan suasana CO 2 5 k. Waktu pengamatan 24 jam Universitas Sumatera Utara 4.4.2 Pasta CaOH 2 adalah bubuk CaOH 2 Merck, Germany murni sebanyak 1 gr yang dilarutkan dengan pelarut air 1 ml hingga berbentuk pasta kental. 4.4.3 Sel fibroblas adalah stem sel Fibroblas BHK-21 yang berasal dari Laboraturium Pusat Veterinaria Farma UNAIR Surabaya dan dibiakkan secara murni pada media Rosewell Park Memorial Institute 1640 RPMI-1640. 4.4.4 Sitotoksisitas adalah viabilitas sel fibroblas BHK-21 terhadap ekstrak etanol A.vera dilihat dari nilai IC 50 , dihitung memakai metode MTT assay dengan menggunakan ELISA reader Enzyme-Linked Immunosorbent Assay pada panjang gelombang 620 nm. 4.4.5 IC 50 ekstrak etanol A.vera adalah konsentrasi dari ekstrak etanol A.vera yang menghambat pertumbuhan sel fibroblas sebesar 50 dari kontrol sel yang diperoleh dari nilai rata-rata persentase kehidupan sel pada waktu pengamatan 24 jam.

4.5 Bahan dan Alat Penelitian

4.5.1 Bahan Penelitian

Ekstraksi A.vera 1. Tanaman A.vera jenis Aloe Barbadensis Miller 1015,5 gram Kelurahan Sidomulyo, Kec. Medan Tuntungan, Sumatera Utara, Indonesia 2. Etanol 96 destilasi Kimia Farma, Indonesia 1,3 liter Uji Screening Fitokimia Ekstrak A.vera 1. Ekstrak kental A.vera Universitas Sumatera Utara 2. Ampas ekstrak A.vera 3. HCl 2N Kimia Farma, Indonesia 10 ml 4. FeCl 3 Kimia Farma, Indonesia 10 ml 5. H 2 SO 4 2N Kimia Farma, Indonesia 10 ml 6. Benzene Kimia Farma, Indonesia 10 ml 7. NaOH 2N Kimia Farma, Indonesia 10 ml Uji Sitotoksisitas 1. Larutan ekstrak etanol A.vera 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78 8 sampel 2. CaOH 2 bubuk Merck, Germany 3. Kultur cell lines fibroblas BHK-21 Pusvetma, Surabaya 4. MTT solution Sigma, St. Louis, OM 5. DimethyilsulfoxideDMSO Merck, Germany 6. Trypsine versene solution 0,25 Merck, Germany 7. RPMI-1640 Pusvetma, Surabaya 8. Phosphate Buffer SalinePBS pH 7 Pusvetma, Surabaya Gambar 6. Bubuk CaOH 2 Universitas Sumatera Utara

4.5.2 Alat Penelitian

Ekstraksi A.vera 1. Freeze dryer modulyo Edwards, USA 2. Electronic balance Ohyo JP2-6000, JAPAN 3. Rotavapor Buchi R-200, Switzerland 4. Blender Phillips, Indonesia 5. Corong buchner mainz, Schoott 6. Erlenmeyer Pyrex, USA 7. Cutter Hakkoh, Japan 8. Kertas saring biasa 9. Sendok pengaduk Gambar 7. Freeze dryer Gambar 8. Rotavapor Uji Screening Fitokimia Ekstrak A.vera 1. Tabung reaksi Pyrex, Indonesia 2. Kayu penjepit Uji Sitotoksisitas 1. 96-well tissue culture plate Nunc,USA Universitas Sumatera Utara 2. Timbangan Mettler, Germany 3. Hemositometer Neubeur, Swiss 4. Scanning multiwell spectrophotometer Thermo Scientific,USA 5. Automatic plate shaker Vari shaker,USA 6. Inkubator Memmert, Germany 7. Micropipette Finnpipette Colour 40 – 200 µ l, China 8. Botol kultur Roux, Schott Duran, Germany 9. Microscope inverted Nikon,Jepang 10. Multi channel pipette ICN, Germany 11. Laminar flow hood Clemco, Australia 12. Sterile pipette tips Eppendorf, North America 10. Tabung steril Pyrex, USA 13. Stopwatch Citizen, Japan 14. Spuit Sterra, Indonesia 15. Filter holder Millipore, USA 16. Nitrocellulose paper Millipore, USA Gambar 9. 96-well tissue culture plate Gambar 10. Microscope inverted Universitas Sumatera Utara Gambar 13. Micropipette Gambar 14. Multi channel pipette Gambar 15. ELISA reader

4.6 Tempat dan Waktu Penelitian

4.6.1 Tempat Penelitian :

1. Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU 2. Laboraturium Penelitian FMIPA USU 3. Laboratorium Pusat Veterinaria Farma UNAIR, Surabaya

4.6.2 Waktu Penelitian

: 6 bulan Gambar 11. Laminar flow hood Gambar 12. Inkubator Universitas Sumatera Utara

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Ekstraksi

A.vera A.vera dicuci bersih Gambar 16, lalu ditimbang sebanyak 1015,5 gram Ohyo JP2 6000, Japan Gambar 17, kemudian diiris tipis + 2 mm Gambar 18, disusun dalam cawan freeze dryer Gambar 19a dan b, dan dimasukkan ke dalam freeze dryer Edwards, USA Gambar 20c untuk pengeringan beku selama 48 jam dengan suhu -30 C dan tekanan 2 atm. Diperoleh 28,2 gram A.vera kering Gambar 21a, kemudian diblender hingga menjadi serbuk Gambar 21c. Berikutnya dilakukan prosedur maserasi. Pertama , Serbuk A.vera kering 28,2 gram yang telah diblender dimasukkan kedalam erlenmeyer ukuran 1 L Gambar 22a, dan ditambahkan etanol 96 sebanyak 600 ml Gambar 22b, didiamkan selama 2 hari sambil digoncang-goncangkan satu kali sehari Gambar 22c. Setelah 2 hari disaring dengan menggunakan kertas saring biasa Gambar 23a dan b melalui corong buchner mainz, Schoott dan diperoleh ekstrak cair sebanyak 380 ml Gambar 23c. Selanjutnya, ampas serbuk A.vera dimaserasi kembali remaserasi selama 2 hari dengan menambahkan etanol sebanyak 350 ml Gambar 24a, ini dilakukan sebanyak dua kali dengan menambahkan etanol dengan jumlah yang sama, yaitu 350 ml total lamanya maserasi = 6 hari dan diperoleh ekstrak cair kembali Gambar 24b. Sehingga total ekstrak cair adalah 880 ml. Seluruh ekstrak cair yang diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan rotavapor Buchi R-200, Switzerland selama 3 jam Gambar 25, sehingga diperoleh 6,6 gram ekstrak kental A.vera . Universitas Sumatera Utara Selanjutnya ekstrak disimpan dalam wadah kaca tertutup berwarna terang Gambar 38. Alur ekstraksi A.vera dapat dilihat pada Lampiran 1. a b Gambar 16. Daun A.vera dicuci bersih Gambar 17. Penimbangan daun A. vera sebanyak 1015,5 gram Gambar 18. Daun A.vera diiris tipis tebalnya + 2 mm Gambar 19. Irisan A.vera disusuna dimasukkan ke dalam cawan freeze dryer sebanyak 7 cawan b Universitas Sumatera Utara c b a a c b b c a Gambar 22. Prosedur maserasi, Serbuk A.vera dimasukkan kedalam erlenmeyer 1 L a, ditambahkan etanol 600 ml b, didiamkan selama 2 hari sambil digoyang-goyangkan c Gambar 20. Cawan disusun didalam freeze dryer a, ditutup dengan tabung penutup freeze dryer b untuk proses pengeringan beku selama 48 jam c Gambar 21. A.vera kering a selanjutnya diblender b hingga menjadi serbuk c Universitas Sumatera Utara Gambar 23. Setelah 2 hari disaring a dan b dan diperoleh ekstrak cair sebanyak 380 ml c b c a b a Gambar 25. Seluruh ekstrak cair yang diperoleh dilakukan pengeringan dengan menggunakan rotavapor Gambar 24. Ampas serbuk A.vera dimaserasi kembali selama 2 hari a dan diperoleh ekstrak cair kembali b Universitas Sumatera Utara

4.7.2 Uji

Screening Fitokimia Ekstrak A.vera Tujuan: untuk mengetahui adatidaknya kandungan antrakuinon, saponin, dan tanin dalam bahan uji ekstrak A.vera dan ampas ekstrak A.vera dengan pelarut etanol 96.

4.7.2.1 Uji Senyawa Saponin

5 tetes ekstrak kental A.vera dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu tambahkan 5 ml air panas, dinginkan. Kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit atau tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2N berarti ada saponin. 4.7.2.2 Uji Senyawa Tanin Ekstrak kental A.vera 5 tetes ditambahkan 2 tetes FeCl 3 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin. Ekstrak kental A.vera 5 tetes sebelumnya dicairkan dengan penambahan aquades + 5 tetes. a b Gambar 26. a. Ekstrak A.vera, b. Ampas ekstrak A.vera Universitas Sumatera Utara

4.7.2.3 Uji Senyawa Antrakuinon

Ekstrak kental A.vera 2 tetes ditambah 2,5 ml H 2 SO 4 2N dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambah 5 ml benzene, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzene dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzene dengan 1 ml NaOH 2N, diamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzene tidak berwarna menunjukkan adanya antrakuinon. Ketiga uji senyawa ini dilakukan juga pada ampas ekstrak A.vera dengan prosedur yang sama untuk membuktikan bahwa tidak ada lagi kandungan saponin, tanin, dan antrakuinon yang tertinggal.

4.7.3 Pembuatan Suspesni Bahan Uji

Pembuatan bahan uji ekstrak etanol A.vera dimulai dari konsentrasi 100 karena belum diketahui konsentrasi ekstrak etanol A.vera yang menimbulkan efek sitotoksik pada sel fibroblas BHK-21 . Ekstrak etanol A. vera disuspensikan dengan media Rosewell Park Memorial Institute 1640 RPMI-1640 dengan perbandingan 1 gram1 ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran bahan secara dilusi pengenceran ganda dengan mengambil setengah dari ekstrak 100 dan ditambahkan 0,5 ml media RPMI untuk mendapatkan konsentrasi 50. Kemudian diambil lagi setengah dari konsentrasi 50 dan ditambah 0,5 ml RPMI untuk mendapatkan konsentrasi 25, begitu seterusnya hingga diperoleh konsentrasi 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, dan 0,78. Universitas Sumatera Utara

4.7.4 Uji Sitotoksisitas

Semua pekerjaan dilakukan dalam Laminar flow. Kultur sel BHK-21 dalam bentuk cell-line ditanam dalam botol roux selama 4 hari. Setelah itu kultur sel dipanen menggunakan trypsine versene solution . Hasilnya kemudian ditanam pada media Rosewell Park Memorial Institute 1640 RPMI-1640 yang terdiri dari 10 serum albumin fetal bovine yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C Gambar 27 . Selanjutnya sel fibroblas didistribusikan pada setiap 96 sumuran well microplate Gambar 28a dan b . Setiap sumuran terdiri dari sel dan media RPMI dengan kepadatan 75 x 10 4 selml dalam 150 µl dan masing-masing diberikan larutan ekstrak A.vera pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78 8 sampel sebanyak 25 µl bahan uji tersebut sebelumnya telah disterilisasi dengan cara filltrasi dengan kertas saring Millipore, USA ukuran pori-pori 0,45 µm dengan waktu kontak bahan uji selama 24 jamGambar 31 . Begitu juga dengan CaOH 2 disiapkan dengan konsentrasi 100 1gr1ml dan diambil supernatant nya saja sebanyak 25 µl. Microplate diinkubasi kembali pada suhu 37 C selama waktu kontak Gambar 32, kemudian pindahkan dari inkubator. Kontrol sel disiapkan, dan dianggap persentase sel hidupnya adalah 100. Kontrol media dianggap persentase sel hidupnya 0. Selanjutnya, garam tetrazolium MTT dilarutkan dalam Phosphate-Buffered Saline PBS 5 mgmL. MTT ditambahkan secara langsung pada plate yang berisi medium kultur sebanyak 10 μl Gambar 33, kemudian diinkubasi kembali selama kurang lebih 4 jam pada suhu 37 C suasana CO 2 5. Seluruh media dalam sumuran dan bahan uji diambil. Universitas Sumatera Utara Kemudian, setiap sumuran ditambahkan DMSO Dimethylsufoxide sebanyak 50 μl Gambar 35. Plate diaduk secara mekanis dengan Plate Shaker sampai kristal formazan terlarut + 10 menit Gambar 36 . Sel fibroblas yang hidup akan terwarnai dengan formazan menjadi biru Gambar 45, sedang yang mati tidak terbentuk warna biru. Selanjutnya, formazan dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan ELISA reader pada panjang gelombang 620 nm Gambar 37b. Hitung rata-rata persentase kehidupan sel dari nilai Optical density absorbansi masing-masing sampel pada setiap konsentrasi terhadap nilai kontrol. Buat grafik persentase kehidupan sel terhadap kelompok perlakuan dan kontrol . Nilai IC 50 selanjutnya dapat ditentukan dari nilai rata-rata persentase kehidupan sel. Alur uji sitotoksisitas dapat dilihat pada Lampiran 2. Persentase kehidupan sel dihitung menggunakan rumus yang digunakan oleh Christian Khoswanto UNAIR, 2008 sebagai berikut: 27 Rumus Umum: Keterangan: kehidupan sel : persentase jumlah kehidupan sel setelah uji Grup tes : nilai OD Optical density formazan setiap sampel setelah tes Media : nilai OD Optical density formazan pada kontrol media Sel : nilai OD Optical density formazan pada kontrol sel Kehidupan sel = Grup tes + media x 100 Sel + media Universitas Sumatera Utara Gambar 27. Kultur cell lines BHK-21 dengan media RPMI-1640 Gambar 28a. Sel fibroblas didistribusikan kedalam 96-well microplate Gambar 31. Bahan uji dimasukkan ke dalam sumuran 25 μlkonsentrasi Gambar 30. Siapkan bahan uji Gambar 29. Kontrol sel diperiksa dengan microscope inverted Gambar 28b. Sel fibroblas dalam 96-well microplate Universitas Sumatera Utara Gambar 33. MTT dilarutkan dalam PBS 5 mgml dan ditambahkan langsung pada plate yang berisi sel fibroblas sebanyak 10 μl dan diinkubasi selama 4 jam Gambar 32. Inkubasi dengan suhu 37 C suasana CO 2 5 selama 24 jam Gambar 35. Seluruh media dan bahan uji dalam sumuran diambil dan ditambah DMSO 50 µl Gambar 34. Hasil uji diperiksa dengan microscope inverted untuk melihat terbentuknya formazan Universitas Sumatera Utara

4.8 Analisis Data

Data dari setiap pemeriksaan dianalisis secara statistik dengan tingkat kemaknaan  = 0,05, memakai uji statistik sebagai berikut : 1. Uji Analisa varians satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan sitotoksisitas antara semua kelompok perlakuan. 2. Uji Low Significant Different LSD, untuk melihat perbedaan sitotoksisitas pada masing-masing kelompok perlakuan. Gambar 37a. Plate dimasukkan kedalam alat ELISA reader Gambar 36. Plate di-shaking dengan plate shaker a b Gambar 37b. Formazan dibaca absorbansinya pada monitor menggunakan panjang gelombang 620 nm Universitas Sumatera Utara

BAB 5 HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS HASIL PENELITIAN

5.1 Hasil Penelitian 5.1.1 Ekstrak A.vera Ekstraksi A.vera dengan menggunakan pelarut etanol 96 telah dilakukan sebelumnya. Dari 28,2 gram serbuk A.vera kering yang telah dihaluskan, diperoleh ekstrak kental sebanyak 6,6 gram. Ekstrak ini berwarna hitam kehijauan dan sedikit kental. Sebelum digunakan untuk uji sitotoksisitas, ekstrak ini dimasukkan dalam wadah kaca berwarna terang dan disimpan didalam lemari pendingin.

5.1.2 Uji

Screening Fitokimia Ekstrak A.vera Untuk memastikan apakah senyawa antrakuinon, saponin, dan tanin telah berhasil diekstraksi pada bahan coba maka dilakukan tes screening fitokimia. Gambar 38. Hasil pembuatan ekstrak A.vera 6,6 gr Universitas Sumatera Utara