4.7.2.3 Uji Senyawa Antrakuinon
Ekstrak kental
A.vera
2 tetes ditambah 2,5 ml H
2
SO
4
2N dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambah 5 ml benzene, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzene
dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzene dengan 1 ml NaOH 2N, diamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzene tidak berwarna menunjukkan
adanya antrakuinon. Ketiga uji senyawa ini dilakukan juga pada ampas ekstrak
A.vera
dengan prosedur yang sama untuk membuktikan bahwa tidak ada lagi kandungan saponin,
tanin, dan antrakuinon yang tertinggal.
4.7.3 Pembuatan Suspesni Bahan Uji
Pembuatan bahan uji ekstrak etanol
A.vera
dimulai dari konsentrasi 100 karena belum diketahui konsentrasi ekstrak etanol
A.vera
yang menimbulkan efek sitotoksik pada sel fibroblas
BHK-21
. Ekstrak etanol
A. vera
disuspensikan dengan media
Rosewell Park Memorial Institute
1640
RPMI-1640
dengan perbandingan 1 gram1 ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran bahan secara dilusi pengenceran
ganda dengan mengambil setengah dari ekstrak 100 dan ditambahkan 0,5 ml media
RPMI
untuk mendapatkan konsentrasi 50. Kemudian diambil lagi setengah dari konsentrasi 50 dan ditambah 0,5 ml
RPMI
untuk mendapatkan konsentrasi 25, begitu seterusnya hingga diperoleh konsentrasi 12,5, 6,25, 3,125, 1,56,
dan 0,78.
Universitas Sumatera Utara
4.7.4 Uji Sitotoksisitas
Semua pekerjaan dilakukan dalam
Laminar flow.
Kultur sel
BHK-21
dalam bentuk
cell-line
ditanam dalam botol
roux
selama 4 hari. Setelah itu kultur sel dipanen menggunakan
trypsine versene solution
. Hasilnya kemudian ditanam pada media
Rosewell Park Memorial Institute 1640 RPMI-1640
yang terdiri dari 10 serum albumin
fetal bovine
yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C Gambar
27
.
Selanjutnya sel fibroblas didistribusikan pada setiap 96 sumuran
well microplate
Gambar 28a dan b
.
Setiap sumuran terdiri dari sel dan media
RPMI
dengan kepadatan 75 x 10
4
selml dalam 150 µl dan masing-masing diberikan larutan ekstrak
A.vera
pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78 8 sampel
sebanyak 25 µl bahan uji tersebut sebelumnya telah disterilisasi dengan cara filltrasi dengan kertas saring
Millipore, USA
ukuran pori-pori 0,45 µm dengan waktu kontak bahan uji selama 24 jamGambar 31
.
Begitu juga dengan CaOH
2
disiapkan dengan konsentrasi 100 1gr1ml dan diambil
supernatant
nya saja sebanyak 25 µl.
Microplate
diinkubasi kembali pada suhu 37 C selama waktu kontak Gambar 32,
kemudian pindahkan dari inkubator. Kontrol sel disiapkan, dan dianggap persentase sel hidupnya adalah 100.
Kontrol media dianggap persentase sel hidupnya 0. Selanjutnya, garam
tetrazolium
MTT dilarutkan dalam
Phosphate-Buffered Saline
PBS 5 mgmL. MTT
ditambahkan secara langsung pada
plate
yang berisi medium kultur sebanyak
10 μl Gambar 33, kemudian diinkubasi kembali selama kurang lebih 4 jam pada suhu
37 C suasana CO
2
5. Seluruh media dalam sumuran dan bahan uji diambil.
Universitas Sumatera Utara
Kemudian, setiap sumuran ditambahkan DMSO
Dimethylsufoxide
sebanyak 50 μl
Gambar 35.
Plate
diaduk secara mekanis dengan
Plate Shaker
sampai kristal formazan terlarut + 10 menit Gambar 36
.
Sel fibroblas yang hidup akan terwarnai dengan formazan menjadi biru Gambar 45, sedang yang mati tidak terbentuk warna
biru. Selanjutnya, formazan dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan
ELISA reader
pada panjang gelombang 620 nm Gambar 37b. Hitung rata-rata persentase kehidupan sel dari nilai
Optical density
absorbansi masing-masing sampel pada setiap konsentrasi terhadap nilai kontrol. Buat grafik persentase
kehidupan sel terhadap kelompok perlakuan dan kontrol
.
Nilai
IC
50
selanjutnya dapat ditentukan
dari nilai rata-rata persentase kehidupan sel. Alur uji sitotoksisitas dapat dilihat pada Lampiran 2.
Persentase kehidupan sel dihitung menggunakan rumus yang digunakan oleh Christian Khoswanto UNAIR, 2008 sebagai berikut:
27
Rumus Umum:
Keterangan:
kehidupan sel : persentase jumlah kehidupan sel setelah uji Grup tes
: nilai OD
Optical density
formazan setiap sampel setelah tes Media
: nilai OD
Optical density
formazan pada kontrol media Sel
: nilai OD
Optical density
formazan pada kontrol sel Kehidupan sel = Grup tes + media x 100
Sel + media
Universitas Sumatera Utara
Gambar 27. Kultur cell lines BHK-21 dengan media RPMI-1640
Gambar 28a. Sel fibroblas didistribusikan kedalam 96-well microplate
Gambar 31. Bahan uji dimasukkan ke dalam sumuran 25 μlkonsentrasi
Gambar 30. Siapkan bahan uji Gambar 29. Kontrol sel diperiksa dengan
microscope inverted Gambar 28b. Sel fibroblas dalam 96-well
microplate
Universitas Sumatera Utara
Gambar 33. MTT dilarutkan dalam PBS 5 mgml dan ditambahkan langsung pada plate yang berisi sel fibroblas sebanyak
10 μl dan diinkubasi selama 4 jam Gambar 32. Inkubasi dengan suhu 37
C suasana CO
2
5 selama 24 jam
Gambar 35. Seluruh media dan bahan uji dalam sumuran diambil dan ditambah
DMSO 50 µl
Gambar 34. Hasil uji diperiksa dengan microscope inverted
untuk melihat terbentuknya formazan
Universitas Sumatera Utara
4.8 Analisis Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis secara statistik dengan tingkat kemaknaan
= 0,05, memakai uji statistik sebagai berikut : 1.
Uji Analisa varians satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan sitotoksisitas antara semua kelompok perlakuan.
2. Uji
Low Significant Different
LSD, untuk melihat perbedaan sitotoksisitas pada masing-masing kelompok perlakuan.
Gambar 37a. Plate dimasukkan kedalam alat ELISA reader
Gambar 36. Plate di-shaking dengan plate
shaker
a
b
Gambar 37b. Formazan dibaca absorbansinya pada monitor menggunakan panjang gelombang 620 nm
Universitas Sumatera Utara
Kategori