40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 5
KESIMPULAN 5.1. Kesimpulan
1. Kondisi optimal proses isolasi DNA dari gummy dan gelatin diperoleh
melalui metode presipitasi DNA kombinasi natrium asetat dan isopropanol dengan perbandingan volume 1:1.
2. Amplifikasi DNA dengan primer spesifik sapi dilakukan sebanyak 40
siklus dan kondisi annealing pada suhu 61ºC. Sedangkan amplifikasi DNA dengan primer spesifik babi dilakukan sebanyak 50 siklus dengan kondisi
annealing pada suhu 60ºC. 3.
Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik sapi menunjukkan bahwa kontrol positif daging sapi, gelatin sapi dan simulasi
gummy sapi teramplifikasi dengan nilai CP 18,27, 25,31, dan 25,49 sedangkan kontrol negatif tidak menunjukkan kurva amplifikasi.
4. Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik babi
menunjukkan bahwa hanya kontrol positif yang teramplifikasi yaitu pada daging babi, gelatin babi, dan gummy babi dengan nilai CP 18,81, 41,62,
37,63.
5.2. Saran
1. Sebaiknya dilakukan optimasi dan validasi metode isolasi DNA agar
mendapatkan isolat DNA dengan kemurnian 1,8-2,0.
2. Sebaiknya dilakukan uji kuantifikasi pada simulasi gummy untuk
mengetahui konsentrasi DNA setelah teramplifikasi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR PUSTAKA
Anonim 2006 . Japanense Pharmacopoeia, Fifteen Edition. Electronic Version. hal.333.
Ardiana, DW.2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya Dan Jeruk Dengan
Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB, Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1,
2009: 12-16. BioDrop. 2012. Quick Start Guide. http:www.biodrop.co.uk. Diakses pada tanggal
30 November 2014 pukul 20.30. Boran, G., Regenstein, J. M. 2010. Chapter 5. Fish gelatin. Advances in Food and
Nutrition Research, 60, 119 –143.
Boore.L.Jeffrey, Survey And Summary Animal mitochondrial genomes, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 8.
Brenstick Stephen.1996.Intisari Biologi. Jakarta: Hipokrates. Campbell, Nail A., Reece, Jane B., Mitchell, Lawrence G. 2002. BIOLOGI Edisi Kelima
Jilid 1, alih bahasa Rahayu Lestari. Jakarta: Erlangga. Cai, H., X. Gu, M.S. Scanlan, D.H. Ramatlapeng and C.R. Lively, 2012, Realtime PCR
assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules, J. Food Compos. Anal., 25, 83-87.
Chacon Griffiths. 2014. Methods for extracting genomic DNA from whole blood
samples: current perspectives, Journal of Biorepository Science for Applied Medicine 2014:2.
Cheng Hon, Rangasamy Murugesan, Tan Yee Sek, Wang Haichuan, Siegfried Blair D.
Evaluation of Five Methods for Total DNA Extraction from Western Corn Rootworm Beetles. Journal Pone; e11963.
Conn, P. 2012. Laboratory Methods in Cell Biology: Biochemistry and Cell Culture Volume 112. UK: Academic Press.
Dennis Lo, Chiu Rossa, Chan Allen.2006. Clinical Application Of PCR Second Edition. New Jersey. Humana Press.
Dean Fraga, Tea Meulia, and Steven Fenster.2008. Current Protocols Essential Laboratory Techniques 10.3.1-10.3.33.
Dirjen POM Departemen Kesehatan Republik Indonesi, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Jakarta.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Erwanto, Y., Abidin, M.Z., Sismindari, dan Rohman, A. 2012. Pig Species Identification in Meatballs Using Polymerase Chain Reaction- Restriction
Fragment Length Polymorphism for Halal Authentication. International Food Research Journal 19 3: 901-906.
Ethel sloane.1995. Anatomi dan Fisiologi Pemula.Jakarta: EGC. Fatchiyah, Arumingtyas L,Widyarti, Rahayu S. 2011. Biologi Molekular. Jakarta :
Erlangga. Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung :Universitas
Padjajaran. Greene, J. 1998.
Recombinant DNA Principles and Methodologies. United States: Marcel Dekker Inc.
http:www.halalmui.org . Diakses pada tanggal 8 April 2014, pukul 09.38 WIB.
Handbook of Pharmaceutical Excipients edisi ke-6.pdf. Hermanto,S., Sumarlin, L., Fatimah, W., 2013.
Differentiation of Bovine and Porcine Gelatin Based on Spectroscopic and Electrophoretic Analysis,
J.Food Pharm.Sci. 1 2013 68-73.
Johansson, Mary Katherine. 2006. Choosing Reporter-Quencher Pairs for Efficient Quenching Through Formation of Intramolecular Dimers. From: Methods in
Molecular Biology, vol. 335: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probe: Design and protocols. Edited by: V.V. Didenko. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Juwono dan Juniarto Zulfa Ahmad,2000. Biologi Sel. Jakarta. EGC. Kieleczawa, 2006.
DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Canada. Jonet and Barllet Publisher.
Kurniati, Elly.2009. Pembuatan Konsentrat Protein dari Biji Kecipir dengan
Penambahan HCl. Jurnal Penelitian Ilmu Teknik 92 : 115
– 122. Marks, BD. Marks, Allan. Smith, MC.1996.Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta.EGC.
Lanelli. 2014. Gummy Vitamins - Gummy Bear Vitamins for Kids. Diambil di
http:pediatrics.about.comodvitaminsa810_gummy_vitamins.htm . Diakses 12
Desember 2014 pukul 21.00. Muladno.2010. Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Kedua. Bogor : IPB Press.
M. Nemati, M. R. Oveisi, H. Abdollahi and O. Sabzevari, Differentiation of Bovine and
Porcine Gelatins Using Principal Component Analysis, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 34, 2004, 485-492.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Moraes,TC., Srivastava, Kirkinezos, 2002. Mitochondrial DNA Structure And Function.
International Review Of Neurobiology, Vol 53. Nhari, R.M.H.R., A. Ismail and Y.B. Che Man, 2012, Analytical methods for gelatin
differentiation from bovine and porcine origins and food products, J. Food Sci., 71, R42-R46.
Phillips, Williams. 2009. Handbook of Hydrocolloid Second Edition. Cambridge: Woodhead publishing limited UK.
Raja Mohd Hafidz, R. N., Yaakob, C. M., Amin, I. and Noorfaizan, A, Chemical and functional properties of bovine and porcine skin gelatin, International Food
Research Journal 18: 813-817 2011. Rapley Ralph, Walker John.2000.Molecular Biology and Biotechnology Fifth
Edition.RSC. United Kingdom. Sambrook, J., Russell, D. W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd
Edition. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Raraswati, A.,Triyana, K., Triwahyudi., Rahman, A. 2012. Differentiation of Bovine
and Porcine Gelatins in Soft Candy Based on Amino
Acid Profiles and Chemometric.
J. Food Pharm. Sci. 2 2014 1-6. Roche
a
. 2012. High Pure PCR Template Preparation Kit. http:www.roche-applied- science.com. Diakses pada 13 November 2014 pukul 17.05
Roche
b
.2008. LightCycler® 480 Probes Master. www.rocheapplied-science.com. Diakses pada 15 November 2014 pukul 12.30
Roche
c
.2008. The
LightCycler® 480
Instrument Opera
tor’s Manual. www.rocheapplied-science.com Diakses pada 20 November 2014 pukul 12.50
Rodriguez, D.,Lazaro.2013. Real-time PCR in Food Science Current Technology and Applications. Spanyol: Caister Academia Press.
Schreiber, R., Gareis, H. 2007. Gelatine Handbook : Theory and Industrial Practice. Jerman : Wiley Vch Verlag Gmbh dan Co. KgaA.
Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria mtDNA dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor : FMIPA IPB. ISSN
0854-8587. Sudjadi.2008.Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta. Kanisius.
Sumardjo, Damin.2006.Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta. EGC.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Suryani,N.,Sulistiawati, F.,Fajriani,A. 2009. Kekuatan Gel Gelatin Tipe B Dalam
Formulasi Granul Terhadap Kemampuan Mukoadhesif. Makara, Kesehatan, Vol.
13, No. 1, Juni 2009: 1-4. Sweetman, S.C. 2009. Martindale 36 The Complete Drug Reference. London: The
Pharmaceutical Press. Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura., and
Hiroshi Akiyama. 2007. A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan : Setagaya-ku, Tokyo.
71 12. 3131-3135.2007.
Tan Alex, 2014. Diambil di http:www.ehow.comabout_6370973_function-tris-
buffer-dna- extraction_.html . Diakses 13 Desember 2014 pukul 13.34 WIB.
Tan, CS., Yiap, BC, 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2009, Article ID
574398, 10 pages doi:10.11552009574398. Wangtueai,S.,Noomhorm,A.2009. Processing optimization and characterization of
gelatin from lizardfish Saurida spp. scales, LWT - Food Science and Technology 42 2009 825
–834. Y.H.Hui.2005. Handbook Of Food Science Technology And Engineering third Volume.
Crc Pr I Llc: China Yuliarti, N. 2009. A To Z Food Supplement First Edition. Yogyakarta : CV Andi Offset.
Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran I. Kerangka Konsep
Pembuatan sampel gummy simulasi vitamin C dari gelatin babi dan gelatin sapi dan berbagai konsentrasi campuran gelatin babi
1,25,50,75
Isolasi DNA dari daging sapi,daging babi, gelatin babi, gelatin sapi, sampel simulasi gummy vitamin C
Amplifikasi DNA dengan Real- Time PCR
Analisa data kurva amplifikasi Real Time PCR
Mengecek konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer biodrop
DNA murni DNA tidak
murni Isolat DNA
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 2. Tabel Komposisi Kit Ekstraksi DNA Roche
Tabel.6. Komposisi Kit Ekstraksi DNA
NO NAMA REAGEN
KOMPOSISI
1 Tissue Lysis Buffer
4M urea, 200mM Tris, 20 mM NaCl,200 mM EDTA,pH 7,4
2 Binding Buffer
6 M guanidine HCl, 10 mM urea, 10 mM Tris- HCl, 20 Triton X-100 vv,pH 4,4
3 Proteinase K
Enzim proteinase PCR grade 4
Inhibitor Removal Buffer 5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl pH 6,6
5 Wash Buffer
20 mM NaCl, 2mM Tris-HCl pH 7,5 6
Elution Buffer 10 mM Tris-HCl pH 8,5
7 High Pure Filter Tube
Berasal dari bahan polipropilen yang terdiri dari dua lapisan serat kaca
8 Collection Tube
Berasal dari bahan polipropilen
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 3. Membuat Larutan Primer dan Probe dan Natrium Asetat
1. Membuat larutan primer dan probe konsentrasi 10 µM dari larutan induk
100 µM V1 . M1 = V2 . M2
X . 100 µM = 100 µ L. 10 µM
X =
= 10 µ L Maka, 10 μL diambil dari masing-masing primer dan probe 100 μM dan
di add 90 μL PCR water grade 2.
Rekomendasi konsentrasi untuk primer LightCycler ® 480 adalah 0.3-1 µM, dipilih konsentrasi 0.8 µM untuk tiap primer
V1 . M1 = V2 . M2 X . 10 µM = 20 µ L . 0.8 µM
X =
6
= 1.6 µ L Maka, diambil 1,6 μL dari larutan primer konsentrasi 10 μM
3. Rekomendasi konsentrasi untuk probe LightCycler ® 480 adalah 0.05-1
µM, dipilih konsentrasi 0.2 µM untuk tiap probe V1 . M1 = V2 . M2
X . 10 µM = 20 µ L . 0.2 µM
X =
= 0.4 µ L Maka, diambil 0,4 μL dari larutan probe konsentrasi 10 μM
4. Membuat larutan natrium asetat konsentrasi 3M
3M =
�� �
x
� ��
8 ,
x
�
gr
=
�8 , �
=
24,609 gr
Maka 24,609 gr Natrium Asetat dilarutkan dalam 100 mL aquadest
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 4. Perhitungan Tm
Melting Temperature Primer
Rumus Tm = 2ºC A+T + 4ºC G+C
1. Primer Sapi
Primer sapi forward
Tm = 2ºC 2+8 + 4ºC 2+8 = 60
Primer sapi reverse
Tm = 2ºC 5+8 + 4ºC 8+3 = 70
Probe sapi
Tm = 2ºC 8+5 + 4ºC 1+11 = 74
2. Primer babi
Primer babi forward
Tm = 2ºC 7+6 + 4ºC 4+7 = 70
Primer babi reverse
Tm = 2ºC 8+7 + 4ºC 6+3 = 66ºC
Probe babi
Tm = 2ºC 9+7 + 4ºC 2+9 = 76ºC
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 5. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA
Tabel .7. Campuran reaksi Hydrolysis Probe mastermix
Konsentrasi Larutan Induk
Jumlah yang digunakan
Primer Forward 0.8
μM 10 μM
1.6 μL Primer Reverse
0.8 μM 10 μM
1.6 μL Probe
0.2 μM 10 μM
0.4 μL LightCycler® 480
Probe Master
- -
10 μL ddH2O
- -
1,4 μL DNA template
- -
5 μL
Total volume reaksi 20 μL
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 6. Hasil BLAST Berdasarkan Informasi NCBI
a.PRIMER BABI