magnetic stirer , autoklaf, inkubator, shaker incubator, vortex, spekrofotometer,.
dan GCMS Agilent 19091S-436
3.3. Metode Penelitian
Metode yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sterilisasi alat, preparasi sampel, ekstraksi dengan metode maserasi, uji adanya senyawa bioaktif dengan
metode BSLT, uji antioksidan dengan metode DPPH, pembuatan medium, peremajaan bakteri uji, uji antibakteri dengan metode difusi cakram, dan analisa
GCMS.
3.4. Cara Kerja 3.4.1. Sterilisasi Alat
Semua alat yang akan digunakan dalam penelitian ini seperti tabung reaksi, cawan petri, disterilkan terlebih dahulu di dalam autoklaf dengan suhu 121
C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm.
3.4.2. Preparasi Sampel
Setelah sampel bunga kecombrang dipanen dilakukan proses pencucian dan penimbangan. Selanjutnya mahkota bunga dilepaskan dari tangkai bunganya dan
dilakukan pengeringan dibawah sinar matahari. Proses penjemuran sampel bunga kecombrang dilakukan diatas tampah kemudian ditutup kain hitam selama 4 jam,
mulai pukul 08.00 hingga pukul 12.00 WIB dan dilakukan pengontrolan setiap satu jam. Setelah proses penjemuran selama 4 jam sampel bunga diangkat.
Proses penjemuran dilakukan selama kurang lebih satu minggu, tujuannya adalah
agar sampel benar-benar terbebas dari air. Sampel akan menjadi kering setelah satu minggu. Penimbangan dilakukan kembali setelah sampel bunga kering
kemudian dihaluskan dengan menggunakan grinding mill dan dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi.
3.4.3. Ekstraksi Bunga Kecombrang
Sebanyak 150 gram sampel dihaluskan dengan menggunakan grinding mill kemudian dimasukkan kedalam beaker glass berukuran 2500 ml. Selanjutnya
aquabidest disiapkan untuk perendaman selama 3x24 jam, setelah itu disaring
menggunakan kertas saring Whatman no.1 dan ditampung dalam sebuah wadah kosong. Hasilnya di uapkan menggunakan Rotary Evaporator dengan suhu 50
C dan kecepatan 90 rpm sehingga yang tersisa adalah ekstrak bunga berupa gel.
3.4.4. Uji Senyawa Bioaktif dengan Metode BSLT 3.4.4.1. Penetasan Larva udang
Bejana untuk penetasan larva udang disiapkan. Kemudian bejana tersebut disekat dengan menggunakan steoroform yang telah beri lobang 10x10 cm. Disatu
ruang dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan diruangan sebelahnya diberi air laut buatan. Ke dalam air
laut buatan dimasukkan ± 50-100 mg telur udang untuk diteteskan. Pada bagian telur ditutup dengan allumunium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk
menetaskan telur. Larva udang diambil yang akan diuji dengan pipet.
3.4.4.2. Persiapan Larutan Sampel yang akan diuji
Ekstrak yang akan diuji dibuat dalam konsentrasi 10, 100, 200, 500, dan 1000 ppm dalam air garam 10. Bila sampel tidak larut ditambahkan DMSO
Dimethyl sulfoxide. Maksimum 50 µl DMSO dalam 5 ml larutan garam Hostettman, 1991.
3.4.4.3. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Sebanyak 100 L air laut yang mengandung larva udang sebanyak 10-12 ekor dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah uji. Larutan sampel
ditambahkan masing-masing sebanyak 100 L, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500 dan 1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan
triplikat. Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah
larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang. Angka mati dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi 3 lubang. Angka hidup
dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam setiap konsentrasi 3 lubang Juniarti, 2009.
Perhitungan akumulasi mati dan hidup larva udang pada tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut:
Tabel 1. Perhitungan Akumulasi larva udang yang mati No Konsentrasi
Akumulasi Mati 1 10
∑ angka mati pada konsentrasi 10 2
100 ∑ angka mati pada konsentrasi 10 + ∑ angka mati pada
konsentrasi 100 3
200 ∑ angka mati pada konsentrasi 10 + konsentrasi 100 + ∑
angka mati pada konsentrasi 200 4
500 ∑ angka mati pada konsentrasi 10 + konsentrasi 100 +
konsentrasi 200 + konsentrasi 500 5
1000 ∑ angka mati pada konsentrasi 10 + konsentrasi 100 +
konsentrasi 200 + konsentrasi 500 + konsentrasi 1000
Tabel 2. Perhitungan Akumulasi larva udang yang hidup No Konsentrasi
Akumulasi Hidup 1 1000
∑ angka hidup pada konsentrasi 1000 2
500 ∑ angka hidup pada konsentrasi 1000 + ∑ angka hidup
pada konsentrasi 500 3
200 ∑ angka hidup pada konsentrasi 1000 + konsentrasi 500 +
konsentrasi 200 4
100 ∑ angka hidup pada konsentrasi 1000 + konsentrasi 500 +
konsentrasi 200 + konsentrasi 100 5
10 ∑ angka hidup pada konsentrasi 1000 + konsentrasi 500 +
konsentrasi 200 + konsentrasi 100 + konsentrasi 10
Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati total dikali 100. Grafik dibuat dengan log
konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC
50
merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian 50 yang diperoleh dengan memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan aktif
atau toksik bila nilai LC
50
1000 ppm untuk ekstrak dan 30 ppm untuk suatu senyawa.
3.4.5. Pengujian Antioksidan
