Tempat dan Waktu Penelitian Alat-alat Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali Recovery

20

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Kualitatif Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, dimulai dari Januari 2013 hingga Maret 2013. 3.2 Bahan-bahan 3.2.1 Sampel Sampel yang digunakan adalah herba seledri daun Apium graveolens L. var. secalinum alef dan sediaan jamu herba seledri yang beredar di pasaran Gambar dapat dilihat pada Lampiran 20, halaman 66 dan Lampiran 21, halaman 67.

3.2.2 Pereaksi

Semua bahan yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro analis keluaran E. Merck yaitu tembaga II sulfat, asam sulfat 96-97, natrium hidroksida, kalium natrium tartrat, perak nitrat, ammonium hidroksida, natrium fosfat, ammonium molibdat kecuali aquadest CV. Rudang Jaya dan vitamin C CSPC Weisheng Pharmaceutical CO., Ltd.

3.3 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spektrofotometer UV-Visible Shimadzu Mini 1240, alat-alat gelas, blender Kris, neraca analitik Boeco, spatula, termometer, penangas air dan stopwatch. Universitas Sumatera Utara 21 3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Ag Ammoniakal Larutkan 3 g AgNO 3 dengan 30 ml aquadest larutan A dan 3 g NaOH dengan 30 ml aquadest larutan B. Kemudian campurkan larutan A dan larutan B dengan perbandingan volume yang sama ke dalam tabung reaksi yang bersih, dan tambahkan larutan ammonia yang telah diencerkan setetes demi setetes hingga perak oksida larut Vogel, 1974.

3.4.2 Pereaksi Fehling

Larutan A. Larutkan 34,64 g kristal CuSO 4 dengan aquadest yang mengandung beberapa tetes asam sulfat, dan encerkan larutan hingga 500 ml Vogel, 1974. Larutan B. Larutkan 60 g NaOH murni dan 173 g garam Rochelle kalium natrium tartrat dengan aquadest, jika perlu disaring, dan diencerkan hingga 500 ml Vogel, 1974.

3.4.3 Pereaksi Fosfomolibdenum

Sebanyak 494,3 mg ammonium molibdat dan 459,0 mg natrium fosfat dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dilarutkan dengan aquadest, ditambahkan 3,26 ml asam sulfat pekat, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda Prieto, et al., 1999. 3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Pengambilan Sampel Sampel yang digunakan adalah herba seledri daun Apium graveolens L. var. secalinum alef yang diambil secara purposif dari Pasar Tradisional Sei Universitas Sumatera Utara 22 Sikambing, Medan, Sumatera Utara dan sediaan jamu herba seledri Apium graveolens L. dari pusat perbelanjaan Hypermart, Sun Plaza, Medan, Sumatera Utara.

3.5.2 Identifikasi Sampel

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanese, Bidang Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.5.3 Prosedur Maserasi Herba Seledri

Seledri dibersihkan, dipotong-potong dan dihaluskan menggunakan blender. Seledri yang telah dihaluskan, dimasukkan ke dalam wadah kaca berwarna gelap, kemudian dimaserasi dengan 1 liter aquadest. Ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, dengan disimpan di dalam lemari gelap, sambil diaduk 6 jam sekali, diambil bagian yang jernih. 3.5.4 Identifikasi Sifat Antioksidan Berdasarkan Daya Reduksi 3.5.4.1 Reaksi Ag Ammoniakal Tambahkan beberapa tetes dari larutan sampel ke dalam 2-3 ml larutan Ag ammoniakal yang mengandung ion [AgNH 3 2 ] + di dalam tabung reaksi yang bersih Vogel, 1974.

3.5.4.2 Reaksi Fehling

Dimasukkan 4 ml larutan Fehling yang baru dibuat dengan mencampurkan larutan Fehling A larutan CuSO 4 dan larutan B larutan alkalin tartrat dalam jumlah yang sama ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2-3 tetes larutan sampel dan didihkan larutan Vogel, 1974. Universitas Sumatera Utara 23 3.5.5 Pengukuran Kapasitas Antioksidan 3.5.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Vitamin C Ditimbang vitamin C sebanyak 100 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dan dilarutkan dengan aquadest sampai garis tanda. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada Larutan Induk Baku LIB I adalah 1000 µgml.

3.5.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Dari LIB I 1000 µgml dipipet 7 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda konsentrasi 140 µgml. Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 5 ml larutan pereaksi fosfomolibdenum. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada larutan ini adalah 12,7273 µgml. Kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 90ºC dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 400-800 nm.

3.5.5.3 Penentuan Waktu Kerja

Dari LIB I 1000 µgml dipipet 7 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda konsentrasi 140 µgml. Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 5 ml larutan pereaksi. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada larutan ini adalah 12,7273 µgml. Kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 90ºC dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada Universitas Sumatera Utara 24 penentuan panjang gelombang maksimum mulai menit ke-21 setelah sampel diinkubasi hingga menit ke-50 dengan interval waktu 1 menit.

3.5.5.4 Pengukuran Kurva Kalibrasi Vitamin C

Dari LIB I dipipet 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml dan 8 ml, masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, diencerkan dengan aquadest hingga garis tanda sehingga konsentrasi vitamin C yang diperoleh adalah 80 µgml, 100 µgml, 120 µgml, 140 µgml dan 160 µgml. Kemudian dipipet masing- masing 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi. Konsentrasi vitamin C yang diperoleh adalah 7,2727 µgml, 9,0909 µgml, 10,9091 µgml, 12,7273 µgml dan 14,5454 µgml. Contoh perhitungan konsentrasi larutan standar dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 43. Kemudian diinkubasi pada suhu 90ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada penentuan panjang gelombang maksimum dalam waktu kerja yang diperoleh.

3.5.5.5 Uji Kapasitas Antioksidan dari Hasil Maserasi Herba Seledri

Dipipet 20 ml hasil maserasi herba seledri, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda. Dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi, diinkubasi pada suhu 90ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada penentuan panjang gelombang maksimum dalam waktu kerja yang diperoleh. Universitas Sumatera Utara 25

3.5.5.6 Uji Kapasitas Antioksidan dari Sediaan Jamu Herba Seledri yang Beredar di Pasaran

Sebanyak 20 kapsul herba seledri ditimbang isinya dan digerus. Kemudian ditimbang serbuk setara 550 mg ekstrak herba seledri dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda. Dipipet 6 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dicukupkan dengan aquadest hingga garis tanda. Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi, diinkubasi pada suhu 90ºC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada penentuan panjang gelombang maksimum dalam waktu kerja yang diperoleh.

3.6 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi atau Limit of Detection LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi atau Limit of Quantitation LOQ merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Menurut Harmita 2004, batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Simpangan Baku = � ΣY � - Yi 2 n - 2 LOD = 3 × SB slope Universitas Sumatera Utara 26 LOQ = 10 × SB slope

3.7 Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali Recovery

Uji perolehan kembali atau recovery dilakukan dengan metode adisi dengan cara menambahkan sejumlah larutan standar vitamin C dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Harmita, 2004. Masing-masing dilakukan sebanyak 6 kali replikasi kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kapasitas sampel. Menurut Harmita 2004, Persen perolehan kembali recovery dapat dihitung dengan rumus dibawah ini: Recovery = C F - C A C A ×100 Keterangan: C F = Kapasitas antioksidan dalam sampel setelah penambahan baku C A = Kapasitas antioksidan dalam sampel sebelum penambahan baku C F = Kapasitas antioksidan baku vitamin C yang ditambahkan

3.8 Analisis Data Secara Statistik