kasus, peningkatan konsentrasi mg
2+
5. Buffer
hingga 4,5 atau 6 mM dapat menurunkan nonspesifik priming.
Tris-Cl disesuaikan pada pH antara 8,3 hingga 8,8 pada suhu ruang, yang dimasukan ke dalam standar PCR pada konsentrasi 10 mM.
ketika diinkubasi pada suhu 72
6. Kation Monovalen C suhu yang biasa digunakan untuk fase
ekstensi PCR, pH campuran turun menghasilkan buffer dengan pH ∼7,2.
Buffer PCR standar mengandung 50 mM KCl yang bekerja baik untuk mengamplifikasi segmen DNA yang panjangnya 500 bp. Dengan
menaikan konsentrasi KCl hingga ∼70-100 mM seringkali dapat
meningkatkan hasil dari segmen DNA yang pendek. 7. Template DNA
Template DNA mengandung urutan target yang akan ditambahkan pada PCR dalam bentuk single strand atau double strand. Amplifikasi
Template DNA sirkular sangat tidak efisien dibandingkan dengan DNA linear.
2.4. Primer spesifik DNA
Dengan menggunakan teknik DNA rekombinan telah dihasilkan klon DNA “spesies spesifik” dan dapat digunakan sebagai DNA probe untuk
mendeteksi spesies tertentu dalam suatu produk daging olahan. Ada beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk mengembangkan pelacak
spesifik. Pendekatan yang memanfaatkan kemajuan bioinformatika dan
teknik PCR, saat ini merupakan salah satu cara yang relatif dapat dilakukan. Pengembangan penanda spesifik gen dengan memanfaatkan informasi dari
database yang diakses dari internet. Dua dari tiga puluh tiga produk makanan yang berlabel halal di Saudi
Arabia dideteksi oleh Abdullah 2008 dengan menggunakan primer spesifik DNA babi dan terbukti mengandung cemaran daging babi. Calvo et al.
2001 telah mengembangkan metode PCR dalam mendeteksi kandungan babi dalam produk daging yang telah dipanaskan dan daging yang belum
dipanaskan. Isolasi DNA spesifik babi dilakukan secara berulang, setelah dianalisis hasil urutan secara berulang, sepasang primer disintesis. Untuk
memastikan efektifitas dan spesifisitas, pengujian dilakukan terhadap 55 sampel DNA dari darah babi yang berasal dari peternakan yang berbeda dan
menunjukan hasil yang positif. Sedangkan sebanyak 200 sampel dengan spesies yang berbeda, menunjukan hasil yang negatif.
Urutan primer dapat dibuat dengan menggunakan software komputer. Urutan nukleotida dianalisis BLAST untuk menentukan daerah-daerah
terkonservasi, dan urutan nukleotidanya dikonfirmasi. Dua diantara daerah tersebut dipilih untuk dasar merancang sepasang primer. Perancangan ini
dapat dilakukan dengan program primer3 secara online ataupun secara semimanual dengan memperhatikan parameter-parameter yang umum,
antara lain jumlah nukleotida, kandungan GC 50 atau lebih Santoso, 2001.
2.5. Desain primer DNA
Pemilihan primer dalam PCR menentukan efisiensi dan spesifisitas PCR. Tujuan dari desain primer adalah spesifitas yang dihasilkan hanya
ketika masing-masing bagian pasang menempel dengan stabil pada target urutan dalam template DNA Sambrook dan Russel, 2001. Primer akan
menempel pada daerah spesifik dan menjadi inisiasi perpanjangan dan penanda akhir dari daerah yang dipilih. Pemilihan primer berhubungan
dengan Tm melting temperature yaitu suhu pada saat untai DNA terpecah menjadi setengah untai tunggal dan setengahnya lagi untai ganda. Tm
mencirikan stabilitas bentuk DNA hybrid, karenanya Tm menjadi pusat parameter dalam desain primer. Tm dipengaruhi oleh panjang primer, urutan
primer, konsentrasi garam, konsentrasi primer, dan ada tidaknya agen denaturasi denaturan
Chen, 2002.
Mulhardt 2007 dalam bukunya Molecular Biology and Genomics,
The Experimenter Series menyatakan bahwa ada beberapa persamaan yang dapat digunakan untuk memperkirakan Tm, dengan menggunakan varian
yang sederhana, Tm dari komponen GC primer dapat diperkirakan dengan menggunakan persamaan berikut:
Tm = 4×nomor G atau C+2×nomor A atau T persamaan ini hanya dapat digunakan untuk primer yang pendek dengan
panjang sekitar 20 basa. Primer dengan komposisi G+C yang tinggi GC memiliki Tm
yang tinggi karena memiliki tiga ikatan hidrogen, sedangkan A-T hanya
memiliki dua ikatan hidrogen. Tm primer biasanya meningkat sesuai dengan panjangnya.
Berikut adalah langkah-langkah pemilihan primer Sambrook dan Russel, 2001.
a.
Analisis gen target untuk priming site yang potensial
b.
Membuat daftar yang memungkinkan untuk forward dan reverse
c.
Memilih pasangan yang terbaik dari forward dan reverse primer yang sama komposisi G+C nya
2.6. DNA Mitokondria
