disebabkan adanya senyawa tambahan pada daging kornet sehingga memerlukan proses optimasi.
4.4.2.1. Isolasi DNA pada daging segar
DNA pada daging segar diisolasi dari daging sapi, daging babi dan campuran daging babi dan daging sapi. Campuran
daging sapi dan daging babi ini digunakan untuk menguji sensitifitas primer spesifik babi.
Proses isolasi DNA pada daging segar adalah sebagai berikut: Sebanyak 500 mg daging dihaluskan, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung sentrifugasi 15 ml, ditambahkan 8 ml cell lysis buffer Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1 wv, ditambahkan 5 µl
proteinase K dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 16-18 jam.
Selanjutnya, campuran ditambahkan 5 µl RNAse, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
C. Sebanyak 750 µl dari campuran tersebut dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5
ml dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk ditambahkan 300 µl natrium
klorida 5 M yang kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang
terbentuk dipisahkan kemudian ditambah dengan 750 µl kloroform-isoamilalkohol 24:1, kemudian dihomogenkan dan
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Setelah itu supernatan dipisahkan dan ditambahkan isopropanol equal
volume, diinkubasi semalam pada suhu -20 C. Selanjutnya
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm, supernatan yang terbentuk dibuang, pelet ditambahkan dengan 600 µl etanol 70,
dihomogenkan dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, DNA
dikeringkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditambahkan buffer TE 30 µl. Keberadaan DNA dicek dengan
menggunakan elektroforesis dan konsentrasinya dicek dengan menggunakan spektrofotometri nanodrop 1000. DNA yang telah
dilarutkan buffer TE disimpan pada suhu -20
4.4.2.2. Isolasi DNA pada kornet
C untuk PCR.
• Preparasi sampel Untuk mendapatkan DNA dari daging kornet,
diperlukan preparasi pada sampel, sehingga senyawa tambahan yang terdapat di dalam produk kornet tidak
mengganggu proses isolasi DNA. Proses preparasi yang dilakukan adalah dengan menggunakan pencucian dan
pemanasan. Proses ini merupakan serangkaian cara untuk memisahkan senyawa tambahan, yang nantinya hanya akan
digunakan satu proses preparasi terbaik sebagai metode terpilih dan digunakan dalam proses isolasi DNA pada
sampel. - Pencucian
Masing-masing sebanyak 1 gr daging kornet dimasukan ke dalam 2 tabung sentrifugasi 15 ml yang
berbeda, kemudian ditambahkan dengan pelarut yang berbeda kepolarannya untuk setiap tabung. Pelarut
yang digunakan yaitu pelarut polar air pada tabung pertama dan pelarut non polar n-heksan pada tabung
kedua. Daging ditiriskan, kemudian masing-masing dihaluskan. Daging yang sudah halus hasil pencucian
kemudian ditambahkan cell lysis buffer untuk isolasi DNA.
- Pemanasan Sebanyak 1 gr daging kornet dihaluskan, kemudian
diletakan di atas kertas saring dengan diameter 10 cm. Daging tersebut dipanaskan pada suhu ± 70
• Isolasi DNA C selama
15 menit. Dengan pemanasan ini diharapkan lemak akan mencair dan terserap oleh kertas saring. Hasil
pemanasan ini kemudian ditambahkan cell lysis buffer untuk isolasi DNA.
Masing-masing sebanyak 1 gr daging kornet dari hasil perlakuan pencucian dan pemanasan dimasukan ke dalam
tabung sentrifugasi 15 ml dan ditambahkan 8 ml cell lysis buffer Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1 wv, kemudian
ditambahkan 5 µl proteinase K dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 16-18 jam. Selanjutnya ditambahkan 5 µl RNAse,
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C dan disentrifugasi
pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit, supernatan yang terbentuk ditambahkan 4 ml natrium klorida 5 M,
dihomogenkan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan
dan ditambahkan dengan 4 ml kloroform-isoamilalkohol 24:1,
dihomogenkan kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dipisahkan dan ditambahkan dengan isopropanol equal
volume, dihomogenkan dan diinkubasi selama semalam pada suhu -20
C. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm, kemudian supernatan dibuang, pelet ditambahkan
dengan 500 µl buffer TE. Larutan DNA yang didapatkan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan
dengan 400 µl kloroform-isoamilalkohol 24:1 dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Penambahan kloroform-isoamilalkohol ini diulangi sebanyak 2 kali, setelah itu supernatan yang dihasilkan ditambahkan
dengan isopropanol equal volume, diinkubasi selama 30 menit dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm, pelet
yang dihasilkan ditambah dengan 200 µl etanol 70, dihomogenkan dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10
menit. Supernatan dibuang, DNA dikeringkan dalam desikator selama 10 menit dan ditambahkan dengan buffer TE
sebanyak 30
µl. Keberadaan DNA dicek dengan
menggunakan elektroforesis dan konsentrasinya dicek dengan menggunakan spektrofotometri nanodrop 1000. DNA yang
telah dilarutkan TE disimpan pada suhu -20 • Pemilihan metode terbaik
C untuk PCR.
Dari hasil isolasi dengan menggunakan berbagai perlakuan tersebut, kemudian dipilih hasil yang terbaik
berdasarkan konsentrasi, kemurnian, pita genom dan hasil amplifikasi dengan menggunakan PCR.
4.4.3. Pembuatan Gel Agarosa dan Elektroforesis
Kategori