24
BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
4.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Gen, Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang. Waktu pelaksanaan
dari bulan Juni 2010 hingga Oktober 2010.
4.2. Alat dan Bahan
4.2.1. Alat
Alat yang digunakan adalah mortar, pestle, pipet mikro 0,1- -
2 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl [Finnpipette, BIO-RAD, Nichiryo, B
enchMate], tip 10 μl, 100 μl dan 1000 μl [Sorenson], freezer -20° C [Angelantoni Scientifica], lemari pendingin 4° C
[Glacio-TOSHIBA], mesin PCR [TaKaRa BIO-RAD], thermostat shaking bath [Heto], tabung sentrifugasi 15 ml
[Iwaki, Corning, FALCON, BIOLOGIX], tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml [Sorenson], tabung mikrosentrifugasi
200 μl [Axygen], rak tabung, mesin sentrifugasi [Beckman J2-HS Tomy], timbangan
[Mettler], ice maker [HOSHIZAKI], vorteks [Heidolph], magnetic stirrer [Heidolph MR3001], inkubator [memmert], microwave
[National], heat
block [Thermolyne], spatula, gunting,
elektroforesis tray [Bio-rad], chamber elektroforesis [Mupid2], comb, gel documentation, dan spektrofotometer Nano Drop ND-
1000. Alat gelas yang digunakan adalah gelas ukur, labu Erlenmeyer 100 ml 250 ml, gelas Beaker 600 ml 1000 ml,
dan tabung penyimpanan bahan 50 ml, 100 ml, 250 ml 500 ml [Schott-DURAN].
4.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging babi, daging sapi dan produk kornet sapi yang dijual di wilayah
Ciputat. Bahan lain yang digunakan yaitu TE Tris-Cl EDTA pH 8,0, etanol 70, isopropanol, NaCl 5 M, DNase-free RNase,
Proteinase K, buffer PCR Fast Star Taq DNA Polymerase Roche, agarosa, buffer 1xTAE, sybr safe 1x, loading dye dan ddH
2
4.3. Tahapan Penelitian
O.
1. Pengumpulan sampel 2. Isolasi DNA sampel dan pembanding
3. Amplifikasi DNA 4. Pembuatan gel agarosa dan elektroforesis
5. Identifikasi hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis 6. Dokumentasi gel
4.4. Prosedur Kerja
4.4.1. Pengumpulan sampel
Sampel kornet sapi dikumpulkan dari semua merek yang beredar di wilayah Ciputat dengan jumlah sampel sebanyak 6 merek produk
kornet sapi dengan produsen yang berbeda.
4.4.2. Isolasi DNA
Proses isolasi DNA pada daging berbeda antara isolasi DNA pada daging segar dengan isolasi DNA pada daging kornet. Hal ini
disebabkan adanya senyawa tambahan pada daging kornet sehingga memerlukan proses optimasi.
4.4.2.1. Isolasi DNA pada daging segar
DNA pada daging segar diisolasi dari daging sapi, daging babi dan campuran daging babi dan daging sapi. Campuran
daging sapi dan daging babi ini digunakan untuk menguji sensitifitas primer spesifik babi.
Proses isolasi DNA pada daging segar adalah sebagai berikut: Sebanyak 500 mg daging dihaluskan, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung sentrifugasi 15 ml, ditambahkan 8 ml cell lysis buffer Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1 wv, ditambahkan 5 µl
proteinase K dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 16-18 jam.
Selanjutnya, campuran ditambahkan 5 µl RNAse, kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
C. Sebanyak 750 µl dari campuran tersebut dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5
ml dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk ditambahkan 300 µl natrium
klorida 5 M yang kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang
terbentuk dipisahkan kemudian ditambah dengan 750 µl kloroform-isoamilalkohol 24:1, kemudian dihomogenkan dan
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Setelah itu supernatan dipisahkan dan ditambahkan isopropanol equal
volume, diinkubasi semalam pada suhu -20 C. Selanjutnya
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm, supernatan yang terbentuk dibuang, pelet ditambahkan dengan 600 µl etanol 70,
dihomogenkan dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, DNA
dikeringkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditambahkan buffer TE 30 µl. Keberadaan DNA dicek dengan
menggunakan elektroforesis dan konsentrasinya dicek dengan menggunakan spektrofotometri nanodrop 1000. DNA yang telah
dilarutkan buffer TE disimpan pada suhu -20
4.4.2.2. Isolasi DNA pada kornet
C untuk PCR.
• Preparasi sampel Untuk mendapatkan DNA dari daging kornet,
diperlukan preparasi pada sampel, sehingga senyawa tambahan yang terdapat di dalam produk kornet tidak
mengganggu proses isolasi DNA. Proses preparasi yang dilakukan adalah dengan menggunakan pencucian dan
pemanasan. Proses ini merupakan serangkaian cara untuk memisahkan senyawa tambahan, yang nantinya hanya akan
digunakan satu proses preparasi terbaik sebagai metode terpilih dan digunakan dalam proses isolasi DNA pada
sampel. - Pencucian
Masing-masing sebanyak 1 gr daging kornet dimasukan ke dalam 2 tabung sentrifugasi 15 ml yang
berbeda, kemudian ditambahkan dengan pelarut yang berbeda kepolarannya untuk setiap tabung. Pelarut
yang digunakan yaitu pelarut polar air pada tabung pertama dan pelarut non polar n-heksan pada tabung
kedua. Daging ditiriskan, kemudian masing-masing dihaluskan. Daging yang sudah halus hasil pencucian
kemudian ditambahkan cell lysis buffer untuk isolasi DNA.
- Pemanasan Sebanyak 1 gr daging kornet dihaluskan, kemudian
diletakan di atas kertas saring dengan diameter 10 cm. Daging tersebut dipanaskan pada suhu ± 70
• Isolasi DNA C selama
15 menit. Dengan pemanasan ini diharapkan lemak akan mencair dan terserap oleh kertas saring. Hasil
pemanasan ini kemudian ditambahkan cell lysis buffer untuk isolasi DNA.
Masing-masing sebanyak 1 gr daging kornet dari hasil perlakuan pencucian dan pemanasan dimasukan ke dalam
tabung sentrifugasi 15 ml dan ditambahkan 8 ml cell lysis buffer Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1 wv, kemudian
ditambahkan 5 µl proteinase K dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 16-18 jam. Selanjutnya ditambahkan 5 µl RNAse,
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C dan disentrifugasi
pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit, supernatan yang terbentuk ditambahkan 4 ml natrium klorida 5 M,
dihomogenkan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan
dan ditambahkan dengan 4 ml kloroform-isoamilalkohol 24:1,
dihomogenkan kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dipisahkan dan ditambahkan dengan isopropanol equal
volume, dihomogenkan dan diinkubasi selama semalam pada suhu -20
C. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm, kemudian supernatan dibuang, pelet ditambahkan
dengan 500 µl buffer TE. Larutan DNA yang didapatkan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan
dengan 400 µl kloroform-isoamilalkohol 24:1 dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Penambahan kloroform-isoamilalkohol ini diulangi sebanyak 2 kali, setelah itu supernatan yang dihasilkan ditambahkan
dengan isopropanol equal volume, diinkubasi selama 30 menit dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm, pelet
yang dihasilkan ditambah dengan 200 µl etanol 70, dihomogenkan dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10
menit. Supernatan dibuang, DNA dikeringkan dalam desikator selama 10 menit dan ditambahkan dengan buffer TE
sebanyak 30
µl. Keberadaan DNA dicek dengan
menggunakan elektroforesis dan konsentrasinya dicek dengan menggunakan spektrofotometri nanodrop 1000. DNA yang
telah dilarutkan TE disimpan pada suhu -20 • Pemilihan metode terbaik
C untuk PCR.
Dari hasil isolasi dengan menggunakan berbagai perlakuan tersebut, kemudian dipilih hasil yang terbaik
berdasarkan konsentrasi, kemurnian, pita genom dan hasil amplifikasi dengan menggunakan PCR.
4.4.3. Pembuatan Gel Agarosa dan Elektroforesis
4.4.3.1. Pembuatan gel agarosa
Gel agarosa 1,2 dibuat dengan menambahkan 0,36 gr agarosa dalam 30 ml buffer TAE 1x, dipanaskan hingga larut
1 menit 20 detik dalam microwave, Larutan agarosa didinginkan hingga suhu 40
4.4.3.2. Elektroforesis
C dan ditambah dengan sybr safe 0,3
μl, dituang ke dalam tray, Agarosa didinginkan hingga membeku selama 30-45 menit.
Gel diangkat dari cetakan dan dimasukan ke dalam chamber elektroforesis kemudian ditambahkan buffer TAE 1x
sehingga gel terendam kira-kira 1 mm. Sebanyak 10 µl sampel DNA dicampur dengan 2 µl loading dye kemudian
dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat elektroforesis dinyalakan diberi arus listrik selama 30 menit. DNA akan
bergerak menuju muatan positif. Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan dokumentasi gel gel documentation.
4.4.4. Gel documentation
Komputer dan kamera digital dinyalakan. Gel agarosa hasil dari elektroforesis dimasukan ke dalam UV transiluminator. UV
transiluminator dinyalakan dan pita DNA akan berpendar saat terkena sinar UV. Hasil gel agarosa saat disinari UV
didokumentasikan dalam komputer.
4.4.5. Amplifikasi PCR
Campuran reaksi total PCR dibuat dalam volume 50 µl pada tabung 0,2 ml. Amplifikasi menggunakan dua jenis primer yaitu primer
spesifik untuk babi; forward: 5’- CAT TCG CCT CAC TCA CAT TAA CC -3’, reverse: 5’- AAG AGA GAG TTC TAC GGT CTG
TAG- 3’ Kesmen et al., 2009 dan primer spesifik untuk sapi; forward: 5’- GCC ATA TAC TCT CCT TGG TGA CA - 3’, dan
reverse: 5’- GTA GGC TTG GGA ATA GTA CGA - 3’ Ilhak, 2006. Campuran reaksi dibuat dengan menggunakan Fast star Taq DNA
Polymerase dan kemudian larutan dihomogenkan lampiran 4. Mesin thermal cycler dice diprogram dengan kondisi denaturasi awal pada
suhu 94 C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94
C selama 45 detik, annealing pada suhu 61
C selama 45 detik, elongasi 72 C selama 90
detik, elongasi akhir pada suhu 72 C selama 5 menit dan suhu
penyimpanan 4 C [
∞].
Amplifikasi DNA pada daging segar dan daging kornet menggunakan program PCR yang sama, yang membedakan adalah
jumlah siklus yang digunakan. Pada proses amplifikasi daging segar, untuk menghasilkan amplikon yang jelas terbaca pada saat
elektroforeis cukup dengan menggunakan 30 siklus, sedangkan pada daging kornet membutuhkan 35 siklus.
4.4.6. Uji spesifikasi primer
Masing-masing primer yang digunakan diuji spesifikasinya dengan menggunakan PCR. Primer spesifik DNA babi digunakan
untuk mengamplifiksi DNA dari daging babi dan DNA dari daging sapi. Begitu juga primer spesifik DNA sapi digunakan untuk
mengamplifikasi DNA dari daging sapi dan DNA dari daging babi. Hasil PCR kemudian dielektroforesis dan dibandingkan. Primer
spesifik DNA sapi dikatakan spesifik jika hanya mengamplifikasi DNA dari daging sapi, tetapi tidak dapat mengampifikasi DNA
dari daging babi. Begitu juga primer spesifik DNA babi dikatakan spesifik jika hanya mengamplifikasi DNA dari daging babi dan
tidak dapat mengamplifikasi DNA dari daging sapi.
4.4.7. Uji sensitifitas primer spesifik DNA babi
Primer spesifik DNA babi diuji sensitifitasnya dengan menggunakan PCR. Template DNA diambil dari hasil isolasi
pencampuran daging antara daging babi dan daging sapi. Gradien konsentrasi yang digunakan adalah sebagai berikut:
Tabel 3. Gradien konsentrasi campuran daging babi dan daging sapi
No Cemaran
daging babi Bobot daging
babi mg Bobot daging
sapi mg Bobot total
sapi+babi mg
1 0.1
2 1998
2000 2
0.5 10
1990 2000
3 1
20 1980
2000 4
2.5 50
1950 2000
5 5
100 1900
2000 6
10 200
1800 2000
Hasil PCR kemudian dielektroforesis, sehingga akan terlihat konsentrasi terkecil yang masih mampu terdeteksi dengan
menggunakan primer spesifik DNA babi.
34
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Hasil
Gambar 6. Hasil elektroforesis isolasi genom daging babi, daging sapi dan campuran daging babi dan daging sapi
Gambar 7. Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer spesifik
DNA sapi dan primer spesifik DNA babi pada daging segar
Keterangan: 1. 0,1 daging babi;
99,9 daging sapi 2. 0,5 daging babi;
99,5 daging sapi 3. 1 daging babi;
99 daging sapi 4. 2,5 daging babi;
97,5 daging sapi 5. 5 daging babi;
95 daging sapi 6. 10 daging babi;
90 daging sapi 7. Daging sapi
8. Daging babi
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
M 1 2 3 4 M
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
227bp 271bp
Gambar 8. Hasil elektroforesis isolasi genom dari daging sapi segar dan
kornet dengan berbagai perlakuan
Gambar 9. Hasil elektroforesis produk PCR daging kornet dengan berbagai perlakuan menggunakan primer spesifik DNA
sapi
Keterangan : 1. Daging sapi segar tanpa perlakuan
2. Daging sapi segar dengan pemanasan 3. Daging sapi segar dicuci dengan n-
heksan 4. Daging sapi segar dicuci dengan air
5. Kornet tanpa perlakuan 6. Kornet dengan pemanasan
7. Kornet dicuci dengan n-heksan 8. Kornet dicuci dengan air
M. Ladder 100 bp
Keterangan : 1.Tanpa perlakuan
2.Perlakuan dengan pemanasan 3. Dicuci dengan n-heksan
4. Dicuci dengan air M. Ladder 100 bp
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
271 bp M 1 2 3 4
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
Gambar 10. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA sapi pada campuran daging babi dan daging sapi
Gambar 11. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA babi pada campuran daging babi dan
daging sapi 1000 bp
500 bp 300 bp
200 bp Keterangan:
1. 0,1 daging babi; 99,9 daging sapi
2. 0,5 daging babi; 99,5 daging sapi
3. 1 daging babi; 99 daging sapi
4. 2,5 daging babi; 97,5 daging sapi
5. 5 daging babi; 95 daging sapi
6. 10 daging babi; 90 daging sapi
7. Daging sapi 8. Daging babi
Keterangan: 1. 0,1 daging babi;
99,9 daging sapi 2. 0,5 daging babi;
99,5 daging sapi 3. 1 daging babi;
99 daging sapi 4. 2,5 daging babi;
97,5 daging sapi 5. 5 daging babi;
95 daging sapi 6. 10 daging babi;
90 daging sapi 7. Daging sapi
8. Daging babi 1000 bp
500 bp 300 bp
200 bp 271 bp
271 bp
Gambar 12. Hasil elektroforesis isolasi genom sampel kornet
Gambar 13. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA sapi pada sampel kornet
Keterangan: 1. Sampel kornet no. 1
2. Sampel kornet no. 2 3. Sampel kornet no. 3
4. Sampel kornet no. 4 5. Sampel kornet no. 5
6. Sampel kornet no. 6
M. Ladder 100 bp
Keterangan: 1. Sampel kornet no. 1
2. Sampel kornet no. 2 3. Sampel kornet no. 3
4. Sampel kornet no. 4 5. Sampel kornet no. 5
6. Sampel kornet no. 6 7. Daging sapi dengan
primer spesifik DNA sapi
8. Daging babi dengan primer spesifik DNA
babi M. Ladder 100bp
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
271 bp 227 bp
Gambar 14. Hasil elektroforesis produk PCR dengan menggunakan primer spesifik DNA babi sampel kornet
Keterangan: 1. Sampel kornet no. 1
2. Sampel kornet no. 2 3. Sampel kornet no. 3
4. Sampel kornet no. 4 5. Sampel kornet no. 5
6. Sampel kornet no. 6 7. Daging babi dengan
primer spesifik DNA babi
8. Daging sapi dengan primer spesifik DNA
sapi M. Ladder 100bp
1000 bp 500 bp
300 bp 200 bp
271 bp 227 bp
5.2. Pembahasan