7
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisis berbagai cuplikan
secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Ditjen POM, 1995.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan Munson, 1991.
2.3.1 Kelebihan KCKT
Menurut Muson 1991, kelebihan KCKT antara lain: −
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran −
Resolusinya baik −
Mudah melaksanakannya −
Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi −
Dapat dihindari terjadinya dekomposisikerusakan bahan yang dianalisis −
Dapat digunakan bermacam-macam detektor −
Kolom dapat digunakan kembali −
Mudah melakukan rekoveri cuplikan −
Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik
Universitas Sumatera Utara
8 −
Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif −
Waktu analisis umumnya singkat
2.3.2 Cara kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel Gandjar dan Rohman, 2007.
2.3.3 Komponen KCKT
Gambar 2 Instrument Dasar KCKT 2.3.3.1 Wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun wadah yang ada labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
pompa
injektor kolom
oven detektor
Wadah
Data processor
Universitas Sumatera Utara
9 Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas
yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis Gandjar
dan Rohman, 2007.
2.3.3.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 mlmenit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa
dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan Gandjar dan Rohman, 2007.
2.3.3.3 Injektor
Menurut Johnson dan Stevenson 1991, ada 3 jenis dasar injektor yaitu: a. Hentikan aliranstop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada sistem tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan
resolusi tidak dipengaruhi.
Universitas Sumatera Utara
10 b. Septum
Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak, umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut- pelarut kromatografi cair. Di samping itu, partikel kecil dari septum yang
terkoyak akibat jarum injektor dapat menyebabkan penyumbatan. c. Katup putaran loop valve
Injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis dengan
adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi LOAD, sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom Johnson dan Stevenson, 1978.
Gambar 3 Tipe Injektor Putaran De Lux Putra, 2007 2.3.3.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom
dapat dibagi menjadi dua kelompok:
Universitas Sumatera Utara
11 a.
Kolom analitik: diameter khas adalah 2 – 6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 – 100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan
pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi De Lux
Putra, 2007.
2.3.3.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh Johnson dan Stevenson, 1978.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan Johnson
dan Stevenson, 1978.
Universitas Sumatera Utara
12
2.3.3.6 Pengolahan data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram Johnson dan
Stevenson, 1978.
2.3.4 Guna kromatogram
Menurut Johnson dan Stevenson 1978, guna kromatogram adalah sebagai berikut:
1. Kualitatif: waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif: luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
2.3.5 Fase gerak
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak
De Lux Putra, 2007. Menurut De Lux Putra 2007, fase gerak harus:
−
Murni, tidak ada pencemarkontaminan
−
Tidak bereaksi dengan pengemas
−
Sesuai dengan detector
−
Melarutkan cuplikan
−
Mempunyai viskositas rendah
Universitas Sumatera Utara
13 Gelembung udara yang ada harus dihilangkan degassing dari pelarut,
karena udara yang keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise
sehingga data tidak dapat digunakan De Lux Putra, 2007. 2.3.6 Elusi gradien dan isokratik
Menurut De Lux Putra 2007, elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap selama elusi.
2. Sistem elusi gradien Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang
perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi.
2.3.7 Jenis pemisahan kromatografi cair kinerja tinggi