Pendahuluan Studi Peran Interaksi Bakteri Patogen Dan Lingkungan Terhadap Penyakit Ice-Ice Pada Rumput Laut Kappaphycus Alvarezii.
Fernandez 2011. Hingga saat ini, belum ada publikasi yang melaporkan analisis filogenetik jenis bakteri penyebab ice-ice menggunakan gen 16S rRNA pada alga
merah Kappahycus alvarezii. Sebelumnya Aris 2011 melaporkan pengembangan metode deteksi secara molekuler untuk bakteri penyebab penyakit ice-ice dengan
primer spesifik PCR berdasarkan sekuen gen 16S rRNA. Dengan demikian penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri kandidat penyebab
penyakit ice-ice melalui uji biokimia dan uji molekuler menggunakan metode sekuensing dengan target gen 16S rRNA.
2.2 Metode Penelitian 2.2.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari-Desember 2015. Sampel rumput laut yang terserang ice-ice dikoleksi dari pembudidaya Kelompok Tani Menara di
Perairan Bulukumba, Sulawesi Selatan. Isolasi bakteri, uji biokimia dan histologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan
BDP, Fakultas Perikanan dan Kelautan FPIK, Institut Pertanian Bogor IPB. Ekstraksi DNA, amplifikasi polymerase chain reaction PCR dilakukan di
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Departemen BDP, FPIK, IPB dan sekuensing gen 16S rRNA dilakukan di First Base Laboratories,
Malaysia. 2.2.2 Bahan dan Metode
Isolasi dan identifikasi bakteri secara biokimia
Bakteri diisolasi dari talus K. alvarezii yang menunjukkan terserang dan tidak terserang ice-ice. Talus diambil sebanyak 1 g dan digerus. Cairan hasil
gerusan diambil sebanyak 0,1 ml dan disebar ke cawan petri berisi media padat sea water complex SWC yang terdiri dari komposisi 5 g bacto-peptone, 5 g yeast
extract, 3 ml gliserol, 250 ml akuades, 750 ml air laut steril dan 20 g bactoagar. Bakteri dikultur pada suhu 28 °C selama 24 jam. Kemudian, hasil isolasi bakteri
digores ulang beberapa kali untuk memperoleh isolat murni dan dilanjutkan evaluasi tipe koloni dan identifikasi secara biokimia.
Ekstraki DNA genom
DNA genom bakteri diekstraksi menggunakan Presto™ mini gDNA bacteria
kit Geneaid, Taiwan. Lisis sel bakteri Gram negatif dilakukan menggunakan bufer GT berisi proteinase K 20 µl dan diinkubasi pada suhu 60 °C selama 10
menit, sedangkan lisis bakteri Gram positif dilakukan menggunakan bufer GT yang mengandung lisozim 4 mgml dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30
menit. Selanjutnya, 20 µl proteinase K ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan pada suhu 60 °C selama 10 menit.
DNA dilarutkan menggunakan 100 µl elution buffer. Hasil isolasi DNA dikonfirmasi dengan pengukuran konsentrasi DNA menggunakan Genquant
Teare et al. 1997 dan pemisahan DNA dilakukan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 1. Visualisasi DNA dilakukan menggunakan pewarna etidium
bromida dengan bantuan cahaya ultraviolet. Larutan DNA disimpan pada suhu -20 °C hingga proses selanjutnya.
Amplifikasi PCR dan analisis nukleotida
Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan menggunakan primer universal Marchesi et al. 1998, yakni 63F
5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ dan 1387R
5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’. Program PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi 94 °C selama 2 menit, 30 siklus amplifikasi
pada suhu denaturasi 92 °C selama 30 detik, annealing 55 °C selama 30 detik, ekstensi 72 °C selama 1 menit dan ekstensi akhir pada suhu 75 °C selama 20
menit. Produk PCR dipisahkan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 1 untuk konfirmasi adanya produk amplifikasi. Selanjutnya, produk PCR
dipurifikasi menggunakan PCR clean up dan gel extraction Geneaid. Hasil purifikasi disekuensing menggunakan mesin ABI3730XL.
Hasil sekuensing diedit dengan bantuan program Bioedit v.7,4 Tamura et al. 2011; Azanza et al. 2013. Selanjutnya, sekuen dianalisis menggunakan basic
local alignment search tool Altschul et al. 1990; Azanza et al. 2013 untuk menentukan spesies bakteri hasil isolasi dengan membandingkan analisis
homologi antara sekuen 16S rRNA isolat dan bakteri yang ada di database. Analisis filogeni
Hasil sekuensing 16S rRNA disejajarkan alignment menggunakan program ClustalW. Analisis filogeni dibuat menggunakan program MEGA v.5,0 Azanza
et al. 2013 dengan boostrap pengulangan sampel 1.000 kali.
2.3 Hasil dan Pembahasan 2.3.1 Identifikasi isolat bakteri
Hasil uji biokimia dilakukan untuk menentukan genus dari isolat bakteri. Berdasarkan uji biokimia diketahui sebagian besar isolat adalah kelompok Gram
negatif Tabel 1. Bakteri yang termasuk Gram negatif ada 6 isolat, yaitu Shewanella sp., Vibrio sp., Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp. dan
Ochrobactrum sp. Dua isolat yang termasuk bakteri Gram positif adalah Arthrobacter sp. dan Bacillus sp. Bakteri yang diisolasi dari permukaan rumput
laut K. alvarezii umumnya adalah Gram negatif dan berbentuk batang. Hal ini sejalan dengan yang umum ditemukan di lingkungan laut Austin 1988 dan juga
pada rumput laut Gracilaria gracilis Jaffray 1998, yakni bakteri Gram negatif dan berbentuk batang.
Komunitas epibakterial berada pada tempat yang berbeda-beda distribusi temporal dan spasial pada talus pada permukaan inang karena keanekaragaman
komposisi biokimia dari talus ganggang coklat, merah dan hijau Longford et al., 2007 dan metabolitnya Steinberg et al., 2002; Paul et al., 2006. Sebagai contoh
alga merah menghasilkan molekul analog dari bakteri lakton N-asil-homoserine AHLs yang berfungsi untuk menghambat sinyal bagi bakteri Gram negatif yang