commit to user 37
B. Seleksi Bakteri Fitase
Dalam berbagai usaha menemukan sumber-sumber enzim baru ataupun usaha peningkatan sifat-sifat enzim sesuai dengan kebutuhan,
terdapat berbagai metode skrining yang digunakan sehingga diperoleh sifat spesifik yang diharapkan. Suatu sistem seleksi atau skrining yang efisien
diperlukan untuk mengidentifikasi spesies-spesies dengan aktifitas fitase. Pengukuran aktivitas fitase pada penelitian ini menggunakan metode Sajidan
2000 yaitu dengan menentukan kadar fosfat melalui spektrofotometri. Aktifitas fitase diartikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalis reaksi yang
menghasilkan 1,0 µmol fosfat anorganik per menit pada kondisi optimum. Penentuan konsentrasi fosfat anorganik dilakukan dengan persamaan regresi
dari kurva standar fosfat. Aktivitas fitase ditentukan dengan mengukur kadar fosfat yang
dihasilkan selama proses enzimatik berlangsung. Filtrat kultur cair bakteri yang mengandung ekstrak kasar enzim direaksikan dengan Na-Fitat,
diinkubasi selama 1 jam. Kemudian ditambahkan komplek asam vanadomolibdofosforik sebagai larutan stop. Senyawa fosfat anorganik dalam
filtrat akan bereaksi dengan reagen ammonium molibdat membentuk kompleks asam molibdofosforik, selanjutnya bersama ammonium vanadat
membentuk komplek asam vanadomolibdofosforik yang berwarna kuning Kusumadjaja, 2009. Vanadat merupakan senyawa yang menghambat
aktivitas fosforilasi enzim fitase dengan cara membentuk komplek bangun trigonal bipiramid Kerovuo et al., 2000. Warna kuning yang terbentuk diukur
nilai absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm. Digunakan kontrol yaitu filtrat kultur bakteri tanpa substrat, untuk membedakan warna kuning
commit to user 38
yang terbentuk karena adanya asam komplek vanadomolibdofosforik Gambar 13.
Gambar 13.
Perbandingan Warna
kuning dari
Reaksi vanadomolibdofosforik yang terbentuk dari ikatan
fosfat dengan vanadat-molibdat antara a control; enzim Fitase tanpa Fitat, tidak menghasilkan fosfat
anorganik, b sampel; enzim fitase dengan Fitat, menghasilkan Fosfat anorganik ditunjukkan dengan
warna yang lebih terang.
Nilai absorbansi lampiran 1 yang terbaca pada spektrofotometer dikonversikan dalam aktivitas fitase UmL dengan persamaan linier yang
diperoleh dari kurva standar KH
2
PO
4
pada beberapa tingkat konsentrasi yang berbeda Lampiran 1. Aktivitas fitase dinyatakan dalam unitmL, yaitu jumlah
enzim yang diperlukan untuk melepaskan 1 mikromol fosfat anorganik permenit pada kondisi pengukuran. Dari aktivitas fitase 16 isolat bakteri
Gambar 14 dipilih 3 isolat bakteri dengan aktivitas fitase tertinggi, yaitu RW Sm A, RW Sm C, RW Sl 5, masing masing berturut-turut memiliki aktivitas
sebesar; 0,1071 UmL, 0,1020 UmL, 0,0874 UmL. Umumnya aktivitas fitase dari bakteri masih jauh lebih rendah
dibandingkan dengan fitase yang dihasilkan oleh kapang, Candida diddensiae mempunyai aktifitas sebesar 676,02 UmL Makhode, 2006.
Aktifitas fitase ketiga isolate juga masih lebih rendah dibandingkan dengan Bacillus cereus ASUIA260 sebesar 1,160 UmL Sobirin et al., 2009, namun
lebih tinggi dibanding Bacillus subtilis AP-17 sebesar 0,0296 UmL Kusumadjaja, 2009.
a b
a b
b
commit to user 39
Gambar 14. Aktivitas fitase dari 16 isolat bakteri RW Sm merupakan isolat dari sampel abu yang diambil di daerah Sleman Yogyakarta , RW Sl merupakan
isolat dari sampel abu yang diambil dari daerah Selo Boyolali
commit to user 40
C. Karakteristik Bakteri Fitase C.1. Morfologi Sel
Kategori