commit to user 28
2. Bahan
Aquades, dH
2
O filter, Master mix PCR goTaq green Promega, agarosa, DNA kit Promega, etidium bromide, kristal violet, safranin.
primer forward Bact F1 5-GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3’, primer reverse Uni B1 5‘-CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘. Marka DNA 1 kb
Fermentas. Media Luria Bertani LB, terdiri dari; 1 tripton, 1 NaCl, 0,5 yeast extract, 2 bacto agar untuk media LB padat, 0,4 Na Fitat
Natrium Fitat untuk media screening, Ammonium molibdate, Ammonium metavanadate, HNO
3
asam nitrat, HCL asam klorida.
C. RANCANGAN PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif. Abu vulkanik gunung Merapi diambil dari Desa Kepuh Harjo Cangkringan Sleman Yogyakarta
dan Lencoh Selo Boyolali. Sampel Abu diambil dari lahan pertanian penduduk.
D. PROSEDUR PENELITIAN 1. Isolasi Bakteri dari sampel Abu Vulkanik
Bakteri fitase diisolasi dari abu vulkanik gunung Merapi dengan menggunakan metode seri pengenceran Platting Method. 1 gram abu dilarutkan
ke dalam 10 ml aquades ditambah larutan NaCl fisiologis 1. Diambil sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis
sehingga didapat pengenceran 10
-2
. Pengenceran dilanjutkan sampai 10
-6
, 10
-7
dan 10
-8
. Masing-masing seri pengenceran diambil 10 µl dimasukkan kedalam cawan Petri yang telah berisi media LB Luria bertani. Kemudian diinkubasi
selama 16 jam pada suhu 37
o
C. Subkultur dilakukan terhadap hasil kultur sebelumnya sehingga diperoleh koloni tunggal.
2. Seleksi bakteri Fitase
Masing masing koloni tunggal ditumbuhkan pada media LB Luria bertani yang mengandung 0,4 Na fitat, dengan komposisi media LB Luria bertani; 1
commit to user 29
Tripton : 1 yeast ekstrak : 2 NaCl. Koloni bakteri diinokulasi pada 10 mL media cair. Diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 16 jam. Produksi ekstrak kasar enzim fitase dilakukan dengan sentrifugasi kultur cair 4000 rpm selama 5 menit pada
suhu 4
o
C. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim fitase. Kemudian dilanjutkan dengan pengukuran aktivitas fitase.
3. Pengukuran Aktivitas Fitase
Pengukuran aktivitas bakteri penghasil fitase dengan metode dari Sajidan 2002: 25 µl enzim, 125 µl susbtrat 0,4 natrium fitat dalam 100 mM Natrium
asetat diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Reak si dihentikan dengan penambahan larutan STOP yang terdiri dari 2,352 g Ammonium molibdate100
ml Aquadest sebagai larutan A, 10 g Ammonium metavanadate100 ml Aquadest sebagai larutan B. Larutan STOP dibuat dengan perbandingan : 1,5 volume
larutan A + 1,5 volume larutan B + 1 volume HNO
3
pekat + 2 volume aquades. Warna kuning dari fosfomolibdovanadat diukur dengan spektrofotometer pada
ʎ= 415 nm
4. Tahap Identifikasi
Bakteri penghasil fitase dengan aktivitas tertinggi selanjutnya dilakukan identifikasi berdasarkan karakter morfologi dan analisis gen 16s rRNA.
a. Pewarnaan Gram dan pengamatan Koloni Kaca objek ditetesi dengan aquades, kemudian jarum ose steril
diusapkan dalam biakan bakteri, dihomogenkan dan difiksasi diatas nyala bunsen ± 30 cm. Usapan yang telah kering ditetesi satu tetes kristal violet
dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya diteteskan satu tetes lugol dan dibiarkan selama 30 detik. Bercak Lugol dibilas sampai warna bilasan bening
menggunakan etanol 95. Kemudian diteteskan larutan safranin, dibiarkan 30 detik dan dibilas dengan aquades. Warna koloni diamati dengan
commit to user 30
mikroskop. Warna ungu pada sel menunjukkan Gram positif dan warna merah menunjukkan Gram negatif.
b. Isolasi DNA Bakteri Isolat bakteri ditumbuhkan dalam medium LB Luria bertani, sebanyak
1 ml kultur disentrifugasi pada 12.000 rpm. Kemudian DNA diekstrak dengan DNA kit Promega USA dengan langkah kerja sebagai berikut:
i. Pellet sel yang diperoleh ditambah 480 µL 50 mM EDTA dicampur sehingga tersuspensi, kemudian ditambahkan 120 µL Lisozim 10mgml
dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 60 menit, kemudian di sentrifuge
12.000 rpm selama 2 menit. Untuk bakteri gram Positif ii. Pellet sel ditambah 600 µL Nuclei Lysis Solution Promega dicampur
sehingga sel tersuspensi kembali. iii. Inkubasi 80
C selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. iv. Ditambahkan 3 µL RNAse Solution Promega mikro tube dibolak balik
sampai tercampur. v. Inkubasi 37
C selama 60 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. vi. Ditambahkan 200 µL Protein precipitation Solution, vortex dengan
kecepatan tinggi selama 20 detik vii. Inkubasi dalam es selama 5 menit, kemudian sentrifuge 12.000 rpm
selama 3 menit. viii. Supernatan dipindahkan ke dalam mikro tube baru yang telah berisi 600
µL isopropanol mikro tube dibolak balik sehingga tercampur dan benang- benang DNA terlihat
ix. Sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dibuang dan tube dikeringkan
commit to user 31
x. Ditambahkan 600 µL 70 etanol, kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit
xi. Mikro tube dikering-anginkan selama 10 sampai 15 menit xii. Ditambahkan 100 µL DNA Rehidration Solution Promega, inkubasi pada
suhu 65 C selama 60 menit.
xiii. Disimpan pada suhu 4 C
Kualitas DNA diketahui melalui spektrofotometer A260 dan kemurnian DNA yang telah berhasil diisolasi di cek melalui elektroforesis
pada agaros gel 1. c. Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction PCR menggunakan universal primer Shobirin et al., 2009 Primer Forward :
5GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3, Primer
Reverse: 5‘CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘. 1 mikrotube reaksi PCR berisi 25 µl
yang terdiri dari; 6, 5 µl master mix PCR go-Taq Green Promega, 2 DNA µl, 2 µl primer forward, 2 µl primer reverse, 12,5 µl dH
2
O filter. Siklus PCR Polymerase Chain Reaction meliputi 3 tahap yaitu; denaturasi, annealing
dan ekstention. Denaturasi awal pada 94°C selama 2 menit dilanjutkan dengan 30 siklus, denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, 45 detik
annealing pada 50° C dan 1.5 menit primer ekstension pada 72°C. Kemudian 72°C ektra ektension selama 5 menit dan terakh ir 4°C selama 1
menit. Pita DNA dari reaksi PCR diamati dengan 1 agarosa, dengan DNA
marker 1 Kb. Setelah itu dilakukan sekuensing pada hasil PCR di laboratorium 1
st
base Singapura.
commit to user 32
5. Karakterisasi Ekstrak Kasar Fitase dari Isolat Terpilih
Isolate bakteri yang mempunyai aktivitas fitase paling tinggi ditumbuhkan dalam 5 ml medium screening cair pada suhu 37
C selama 16 jam. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit pada
suhu 4 C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar fitase.
Karakterisasi ekstrak kasar fitase meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, efektor logam MgCl
2
, ZnCl
2
, CaCl
2
, FeCl
3
pada 10
-3
dan 10
-4
M, stabilitas pH dan stabilitas suhu. 5.1. pH optimum
pH optimum ditentukan dengan cara mengukur aktivitas enzim pada berbagai pH substrat yaitu pada rentang 3 – 9. 0,4 Na-fitat dalam 100 mM
Na-asetat digunakan sebagai substrat di atur tingkat keasamannya sehingga mempunyai pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
5.2. Suhu optimum Suhu optimum ditentukan dengan cara mengukur aktifitas enzim pada
berbagai suhu inkubasi enzim-substrat. Mulai dari suhu diruang, 37 C, 40
C, 50
C, 60 C, 70
C, 80 C. Ekstrak kasar enzim fitase sebanyak 25 µL
ditambahkan substrat 125 µL dan diinkubasi selama 60 menit pada berbagai suhu yang telah ditentukan tersebut. Setelah itu ditambahkan 400 µL larutan
STOP, kemudian diukur absorbansi larutan pada ʎ = 415 nm.
Stabilitas termal enzim diketahui dengan memanaskan enzim pada suhu optimum selama rentang waktu tertentu dan diukur aktivitasnya sampai
enzim tidak memperlihatkan aktivitas yang signifikan. Pada pengukuran stabilitas pH dilakukan dengan cara melarutkan enzim dalam larutan buffer
dengan berbagai pH. Masing masing campuran diinkubasi pada suhu
commit to user 33
optimum selama 1 jam kemudian diukur aktifitas fitase pada tiap-tiap pH tersebut.
5.3. Efektor Logam Kedalam setiap larutan enzim-substrat ditambahkan 10 µL FeCl
3
, MgCl
2
, CaCl
2
, dan ZnCl
2
dengan konsentrasi 10
-3
dan 10
-4
M. Kemudian diinkubasi pada pH dan suhu optimum selama 60 menit.
E. ANALISIS DATA
Kategori