UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menggunakan metode elektroforesis, sedangkan konsentrasi dan kemurnian DNA dicek dengan menggunakan spektrofotometri Nano Drop 1000. DNA yang telah
dilarutkan disimpan pada suhu -20
o
C Kesmen et al., 2009. 3.4.2. Elektroforesis
Gel agarosa 1 digunakan untuk elektroforesis DNA genom dan hasil produk PCR. Untuk pembuatan gel agarosa 1, ditimbang sebanyak 0,3 gr atau
0,6 gr agarosa dan kemudian dilarutkan dengan 30 mL atau dengan 60 mL TAE 1x, lalu dipanaskan di dalam microwave selama 1 menit sampai agarosa menjadi
larut dan larutan berwarna bening. Selanjutnya larutan agarosa didinginkan hingga suhu 40
o
C, kemudian ditambahkan 0,6 µL atau dengan 1,2 µL sybr safe dan dihomogenkan, lalu dituang ke dalam gel caster yang telah disisipkan comb.
Selanjutnya agarosa didiamkan hingga membentuk gel padat. Setelah terbentuk gel padat, gel diletakkan pada chamber elektroforesis
dengan posisi sumur pada muatan negatif. Kemudian buffer TAE 1x dituang hingga gel terendam dalam chamber elektroforesis namun tidak melebihi garis
batas maksimum. Pencampuran sampel yang akan dielektroforesis dilakukan dengan
menggunakan parafilm. DNA sampel yang digunakan sebanyak 5 µL dan ditambah 1 µL Loading dye. Kemudian marker DNA diletakkan di sumur paling
kiri, diikuti selanjutnya DNA sampel. Chamber elektroforesis ditutup rapat. Alat elektroforesis dinyalakan diberi
arus listrik dengan tegangan 100 Volt selama 30 menit untuk DNA genom dan 20 menit untuk produk PCR. DNA akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan
positif.
3.4.3 Dokumentasi Gel
Komputer dan kamera digital dinyalakan. Gel agarosa hasil elektroforesis dimasukkan ke dalam UV transiluminator. UV transiluminator dinyalakan dan
pita DNA akan berpendar saat terkenar sinar UV. Pendaran tersebut dapat didokumentasikan dengan software yang terhubung dengan kamera sehingga
gambar yang ditangkap oleh kamera kemudian disimpan dalam komputer.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.4
Optimasi Suhu Annealing dengan menggunakan Metode Gradien PCR
Uji ini dilakukan untuk mengetahui suhu optimal primer babi dan primer sapi pada proses annealing. Pada PCR di setting pembuatan gradien suhu
annealing. Rentang suhu yang digunakan untuk pembuatan gradien suhu annealing adalah 50-65
o
C. 3.4.5
Uji Spesifitas primer
Setelah didapat suhu annealing optimum dari primer babi dan primer sapi selanjutnya diuji spesifitasnya dengan menggunakan PCR. Primer babi dapat
dikatakan spesifik jika primer babi hanya dapat mengamplifikasi sekuen DNA babi, begitu juga pada primer sapi yang hanya dapat mengamplifikasi sekuen
DNA sapi.
3.4.6 Uji Sensitivitas primer
Primer babi dan primer sapi diuji sensitivitasnya dengan menggunakan PCR. Pengujian ini ditujukan untuk melihat konsentrasi terendah yang masih
dapat terdeteksi dengan menggunakan primer babi dan primer sapi. Gradien konsentrasi yang digunakan yaitu 20 ng 25 µl, 10 ng 25 µl, 2 ng 25 µl, 0,2 ng
25 µl, dan 0,02 ng 25 µl.
3.4.7 Insulated Isothermal PCR
Optimasi alat insulated isothermal PCR dilakukan untuk mengetahui konsentrasi Taq polymerase, dNTP, buffer, primer, DNA template optimal untuk
dapat mengamplifikasikan DNA babi dan DNA sapi. Uji ini dilakukan dengan campuran reaksi primer-probe, uni-ii buffer, probe, dNTP, DNA template, DNA
polymerase. Setelah campuran reaksi total PCR dibuat, campuran reaksi tersebut
dimasukkan ke dalam R-tube, disentrifugasi, kemudian diletakkan pada mesin insulated isothermal PCR. Kemudian program amplifikasi dijalankan dan hasil
amplifikasi DNA dapat dilihat pada akhir reaksi dalam bentuk “+” atau “-”.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.5. Alur Penelitian
Persiapan daging babi segar dan daging sapi segar
Isolasi DNA
Cek keberadaan DNA dengan elektroforesis
DNA tidak ada DNA ada
Cek konsentrasi DNA
PCR 1. Optimasi Suhu
Annealing 2. Uji spesifitas
primer 3. Uji sensitivitas
primer Insulated Isothemal PCR
Hasil
Kesimpulan
26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolasi Genom
Genom diisolasi dari daging babi dan daging sapi yang didapatkan dari pasar swalayan yang berada di Lebak Bulus. Masing-masing sampel diisolasi
sebanyak 500 mg dengan menggunakan metode cell lysis buffer berupa Tris-Cl pH 8, EDTA pH 8, dan SDS 1 wv Kesmen et al., 2009; Kumari, 2007;
Sambrook dan Russel, 2001 dengan beberapa modifikasi diantaranya volume sampel dan pereaksi, kecepatan sentrifugasi, dan urutan langkah kerja.
Isolasi dimulai dengan menginkubasi sampel dalam cell lysis buffer dan Proteinase K pada suhu 55
o
C selama 16 jam. Cell lysis buffer yang digunakan mengandung SDS Sodium Dodecyl Sulfate yang merupakan deterjen anionik
yang dapat melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran. Pada proses lisis sel, EDTA mempunyai dua
fungsi. Pertama, EDTA mengikat ion logam divalen Mn
2+
, Mg
2+
yang dapat membentuk garam dengan grup anionik fosfat pada DNA. Kedua, EDTA
menghambat DNAse yang membutuhkan Mg
2+
atau Mn
2+
Dale dan Malcom, 2002. Tris berperan sebagai buffer selama proses isolasi yang dapat menjaga pH
7,4-9,0 karena DNA dapat mengalami denaturasi pada pH ekstrim pH5 atau pH16 Ageno et al., 1969; Marmur dan Lane, 1958; Sambrook dan Russel,
2001. Kontaminasi protein dikurangi dengan menggunakan Proteinase K, yang
merupakan protease endolitik golongan serin protease dengan aktivitas tinggi Sambrook dan Russel, 2001. Proteinase K memotong ikatan peptida yang
berdekatan dengan grup karboksil dari asam amino alifatik dan aromatik. Proteinase K menunjukkan aktivitas optimal pada pH 7,5
– 9 Sambrook dan Russel, 2001; Sweeney Walker, 1993 dan distimulasi dengan SDS pada
konsentrasi 0,1 hingga 1 Hilz et al., 1975. Setelah proses lisis berakhir komponen-komponen yang ditimbulkan akibat perusakan sel dipisahkan dengan
cara sentrifugasi.
