UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk di antara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan
terlihat di bawah lampu UV Gaffar, 2007. Larutan etidium bromida sangat berbahaya dan bersifat karsinogen. Semua larutan yang mengandung etidium
bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang Muladno, 2010. Untuk menghindari bahaya yang ditimbulkan oleh etidium bromida, maka dapat
menggunakan larutan SYBR safe sebagai penggantinya. Menurut Sambrook dan Russel 2001 pewarna SYBR safe membuat DNA berpendar di bawah sinar UV.
Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa terdapat DNA pada setiap lajur.
2.6. Insulated Isothermal PCR
Insulated isothermal PCR merupakan suatu teknik berbasis PCR yang memanfaatkan fenomena konveksi termal alami untuk menggandakan jumlah
molekul DNA pada target tertentu. Reaksi ii-PCR dilakukan di dalam sebuah tube kapiler yang telah didesain secara khusus di dalam sebuah chamber POCKIT.
Ketika pemanasan dengan suhu 95
o
C diaplikasikan pada bagian bawah dari R- tube, larutan yang panas menjadi ringan dan berpindah ke atas, dan larutan yang
dingin yang lebih berat dan berpindah ke bawah. Reaksi PCR dapat terjadi karena adanya gradien temperatur di dalam tube dimana, secara teori, proses denaturasi
akan terjadi di bagian bawah, annealing di bagian atas, dan elongasi terjadi di
bagian tengah R-tube.
Karena reaksi PCR dijalankan dalam temperatur gradien dengan konveksi termal tanpa harus menaikkan dan menurunkan suhu secara berulang, maka satu
siklus PCR hanya berlangsung selama 15-20 detik, dan lebih efektif dari PCR
konvensional.
Reagen yang digunakan di dalam alat POCKIT hampir sama dengan yang digunakan dalam reaksi PCR, termasuk primer, dNTP, buffer, DNA polymerase,
dan template. Untuk meningkatkan spesifitas reaksi, POCKIT dilengkapi dengan dua perekam fluorosens yang mendeteksi sinyal fluoresens dari target asam
nukleat. Jadi, seperti system real-time PCR, probe flurogenik juga dibutuhkan.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Beberapa komponen insulated isothermal PCR yang perlu diperhatikan
yaitu:
1. Buffer
Insulated isothermal PCR menggunakan Buffer Uni-II yang mengandung reagen-reagen yang berfungsi untuk mengoptimasi laju konveksi termal,
menstabilisasi gradien temperatur, mengurangi interaksi antara larutan dan R- tube, dan meningkatkan efisiensi DNA polymerase untuk keberhasilan reaksi
iiPCR.
2. R-tube
Tube terbuat dari bahan plastik optik yang memastikan transmisi fluoresensi yang optimal. Bahan plastik berkelas medis juga memastikan bahwa
produk bebas dari DNase dan RNase. Tube telah dipatenkan dengan rasio diameter dan panjang tertentu yang memastikan konveksi isotermal untuk reaksi
iiPCR yang optimal. Tutup yang didesain secara khusus menjaga keamanan reaksi larutan dan mencegah penguapan pada saat reaksi berlangsung yang dapat
menyebabkan kontaminasi. 3.
Primer Desain primer untuk ii-PCR harus memenuhi persyaratan sebagai berikut:
a. Amplikon harus kurang dari 150 bp, semakin pendek semakin baik. b. Tm melting temperature harus pada rentang 58±2
o
C c. Primer harus mempunyai kandungan GC antara 45-60
d. Hindari 4 atau lebih pengulangan G atau C. e. Hindari pengulangan ATATATATATAT
f. Lima basa terakhir pada ujung 3’ harus mempunyai 1-3 G atau C.
g. Potensi untuk membentuk primer-dimer harus seminimal mungkin. h. Hindari pembentukan bentuk homo-, hetero-dimer, dan hairpin
4. Probe
Probe POCKIT harus: a. Terdiri dari 40-80 GC
b. Mempunyai panjang 15-30 basa, lebih pendek lebih baik. c. Menghindari daerah target pada template yang dapat membentuk
struktur sekunder.
21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
