Isolasi Genom HASIL DAN PEMBAHASAN

26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi Genom

Genom diisolasi dari daging babi dan daging sapi yang didapatkan dari pasar swalayan yang berada di Lebak Bulus. Masing-masing sampel diisolasi sebanyak 500 mg dengan menggunakan metode cell lysis buffer berupa Tris-Cl pH 8, EDTA pH 8, dan SDS 1 wv Kesmen et al., 2009; Kumari, 2007; Sambrook dan Russel, 2001 dengan beberapa modifikasi diantaranya volume sampel dan pereaksi, kecepatan sentrifugasi, dan urutan langkah kerja. Isolasi dimulai dengan menginkubasi sampel dalam cell lysis buffer dan Proteinase K pada suhu 55 o C selama 16 jam. Cell lysis buffer yang digunakan mengandung SDS Sodium Dodecyl Sulfate yang merupakan deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran. Pada proses lisis sel, EDTA mempunyai dua fungsi. Pertama, EDTA mengikat ion logam divalen Mn 2+ , Mg 2+ yang dapat membentuk garam dengan grup anionik fosfat pada DNA. Kedua, EDTA menghambat DNAse yang membutuhkan Mg 2+ atau Mn 2+ Dale dan Malcom, 2002. Tris berperan sebagai buffer selama proses isolasi yang dapat menjaga pH 7,4-9,0 karena DNA dapat mengalami denaturasi pada pH ekstrim pH5 atau pH16 Ageno et al., 1969; Marmur dan Lane, 1958; Sambrook dan Russel, 2001. Kontaminasi protein dikurangi dengan menggunakan Proteinase K, yang merupakan protease endolitik golongan serin protease dengan aktivitas tinggi Sambrook dan Russel, 2001. Proteinase K memotong ikatan peptida yang berdekatan dengan grup karboksil dari asam amino alifatik dan aromatik. Proteinase K menunjukkan aktivitas optimal pada pH 7,5 – 9 Sambrook dan Russel, 2001; Sweeney Walker, 1993 dan distimulasi dengan SDS pada konsentrasi 0,1 hingga 1 Hilz et al., 1975. Setelah proses lisis berakhir komponen-komponen yang ditimbulkan akibat perusakan sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Supernatan yang terbentuk masih mengandung pengotor lipid, protein, RNA, dan karbohidrat Dale and Malcom, 2002. Supernatan diinkubasi dalam RNAse dan natrium klorida 5 M pada suhu 37 o C selama 1 jam. RNAse merupakan endoribonuklease yang mengkatalisis degradasi untai tunggal RNA dengan pemotongan rantai 3’, 5’-fosfodiester, dimana basa dari nukleotida pada ikatan di posisi 3’ yang akan dipotong merupakan pirimidin Moussaoui et al., 2007; Raines, 1998. Penambahan natrium klorida 5 M berfungsi untuk mengendapkan protein dan kontaminan lainnya. Konsentrasi garam yang tinggi dapat mengendapkan protein karena adanya fenomena salting-out. Purifikasi DNA dilakukan untuk menghilangkan kontaminan selain DNA. Metode purifikasi DNA yang dilakukan adalah ektraksi fenol-kloroform. Campuran fenol-kloroform mempunyai berat jenis yang berbeda dengan air sehingga ketika dicampurkan terbentuk dua fase, dimana fase fenol-kloroform berada di bawah karena memiliki berat jenis yang lebih besar. DNA bersifat polar karena mengandung muatan negatif akan larut dalam fase air. Fenol dan kloroform akan mendenaturasi protein dan kontaminan lainnya. Penggunaan kloroform juga digunakan untuk memperkecil zona interfase sehingga terdapat perbedaan jelas antara fase air dan fase organik. Isoamil alkohol digunakan sebagai anti foaming agent yang dapat menjaga kestabilan interfase sehingga memperjelas batas fase air dan fase organik. Sambrook dan Russel, 2001. DNA dipisahkan dari larutan dengan cara presipitasi dengan menggunakan alkohol yang dapat berupa isopropanol atau yang lebih sering etanol Sambrook dan Russel, 2001; Dale dan Malcom, 2002. Proses presipitasi dibantu dengan garam yang berfungsi untuk menetralkan muatan pada gugus fosfat DNA. Garam yang umumnya digunakan adalah natrium asetat. Dalam larutan, natrium asetat akan terionisasi menjadi Na + dan CH 3 COO - dimana Na + akan berinteraksi dengan gugus fosfat PO 4 2- pada DNA. Ikatan Na + dan fosfat PO 4 2- yang terbentuk akan menyebabkan DNA menjadi kurang hidrofilik. Interaksi ion di dalam larutan dipengaruhi oleh konstanta dielektrik pelarut. Etanol dalam hal ini berperan untuk menurunkan konstanta dielektrik air yang mempermudah interaksi ion Na + dan PO 4 2- sehingga membuat DNA menjadi kurang hidrofil dan dapat mengendap. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Inkubasi campuran DNA dilakukan pada suhu -20 o C karena suhu yang rendah mendukung flokulasi DNA untuk membentuk kompleks presipitat yang lebih besar, sehingga DNA dapat dengan mudah terbentuk pelet dengan sentrifugasi. Pada langkah berikutnya, 70 etanol ditambahkan ke dalam pelet dan divortex untuk melonggarkan pelet, sehingga etanol dapat berpenetrasi dan membersihkan garam-garam yang terikat pada DNA. Suspensi yang terbentuk kemudian disentrifugasi selama 5 menit dimana pelet akan terbentuk kembali. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan menguapkan sisa etanol dengan menggunakan desikator. Pelet DNA yang telah kering dapat dilarutkan dengan air ddH2O ataupun TE buffer Muladno, 2010. Gel divisualisasikan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 dengan tegangan 100 volt. Loading Dye terdiri dari sebuah pewarna yaitu bromophenol blue yang berfungsi untuk visualisasi pergerakan DNA pada saat elektroforesis dicampurkan ke dalam genom. Adanya gliserol di dalam loading dye memastikan bahwa DNA di dalam ladder dan sampel membentuk lapisan di bawah sumur gel. Pada gambar 4 menunjukkan hasil isolasi genom dari daging sapi dan daging babi. Gambar 4. Elektroforesis hasi isolasi genom daging sapi dan daging babi Keterangan: M. Marker 100bp 1. Genom Daging Babi 2. Genom Daging Sapi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 4 menunjukkan pita yang smear. Hasil pita yang smear pada gel elektroforesis dapat disebabkan tidak utuhnya DNA yang terisolasi dimana fragmen-fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda tertahan oleh gel sesuai dengan ukurannya. Karena antar satu fragmen dengan fragmen lainnya memiliki ukuran yang hampir sama maka pita tampak menyatu. Terjadinya fragmentasi DNA pada daging segar dikarenakan genom yang terisolasi mengalami degradasi baik pada saat penyimpanan maupun selama proses isolasi berlangsung, namun hasil isolasi tersebut masih dapat digunakan untuk PCR selama di dalamnya terdapat target yang diinginkan Anonim d , 2013. Konsentrasi genom hasil isolasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer Nano Drop ND-1000 pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Konsentrasi genom yang dihasilkan dari sampel daging babi adalah 713 ngµl, sedangkan daging sapi adalah 746 ngµl Lampiran 1. Asam nukleat dan protein mempunyai absorban maksimum pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Rasio absorban pada kedua panjang gelombang ini digunakan untuk pengukuran kemurnian dari ekstraksi DNA dan protein, dimana rasio 1,8 – 2 secara umum diterima sebagai nilai kemurnian untuk DNA Thermo Scientific, 2012. Nilai A 260 A 280 hasil isolasi genom babi adalah 1,81, sedangkan genom sapi 1,67. Pada gambar 4 terlihat pita yang memisah pada bagian bawah dari semua lajur yang menandakan keberadaan RNA, namun dalam jumlah sedikit sehingga tidak perlu dilakukan pemurnian ulang.

4.2. Polymerase Chain Reaction