Pengukuran aktivitas enzim peroksidase. Ekstrak daun diencerkan

Identifikasi dan karakterisasi molekuler DNA genom diekstraksi menggunakan XPrep Stool DNA Mini Kit Philekorea Technology, INC. Seoul Korea dengan mengikuti prosedur yang direkomendasikan oleh produsennya. DNA yang diperoleh digunakan sebagai template untuk amplifikasi 16S rDNA dan beberapa gen lainnya. Amplifikasi DNA 16S rRNA dilakukan menggunakan pasangan primer 63f 5’- CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ dan 1387r 5’-GGGCGGWGTGTACAA- GGC-3’ sebagaimana yang dipublikasikan oleh Marchessi et al. 1998. Komposisi dan kondisi reaksi reaksi PCR dipaparkan pada Tabel 2 dan 3. Amplikon dikirim ke perusahaan jasa sekuensing Genetika Science Indonesia untuk proses sekuensing DNA. Sekuen DNA yang diperoleh dianalisa kesejajarannya menggunakan Program Clustal W Thompson et al. 1994 dan dibandingkan dengan basis data sekuen DNA 16S rRNA yang terdapat gene bank. Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan neighbor-joining method with Maximum Composite Likelihood model in Mega 5.05 Tamura et al. 2011. Tabel 2 Komposisi campuran reaksi PCR untuk amplifikasi 16S rDNA G053 dan G062 Komponen reaksi Konsentrasi akhir G053 G062 Bufer untuk KOD Hot Start polymerase MgSO 4 dNTPs masing-masing Primer “Forward” Primer “Reverse” Template DNA KOD Hot Start DNA polymerase Phusion Master Mix 1x 1.5 mM 0.2 mM 0.3 μM 0.3 μM 100 ng 0.02 UµL - - - - 0.3 μM 0.3 μM 100 ng - 1x Tabel 3 Kondisi reaksi PCR amplifikasi 16S rDNA G053 dan G062 Tahapan reaksi Durasi G053 G062 Polymerase activation Denaturation Annealing Extention Final extention 95 ⁰C, 2 menit 95 ⁰C, 30 detik 56.5 ⁰C, 45 detik 73 ⁰C, 1 menit 15 detik 73 ⁰C, 2 menit 95 ⁰C, 2 menit 95 ⁰C, 2 detik 55 ⁰C, 30 detik 72 ⁰C, 1 menit 72 ⁰C, 5 menit Potensi genetik produksi of 2,4-diasetilfloroglusinol DAPG oleh isolat G062 dideteksi menggunakan pasangan primer phl2a 5’-GAGGACGTCGAA- GACCACCA-3’ dan phl2b 5’-ACCGCAGCATCGTG-TATGAG-3’, sedangkan untuk produksi gen pyrrolnitrin dengan menggunakan pasangan primer prnCf 5’-CCACAAGCCCGGCCAGGAGC-3’ dan prnCr 5’-GAGAAG- AGCGGG-TCGATGAAGCC-3’. Kondisi amplifikasi untuk kedua gen metabolit sekunder tersebut sebagaimana kondisi PCR yang dipublikasikan oleh Raaijmakers et al. 1997 dan Mavrodi et al. 2001. Karakterisasi fisiologis dan biokimia a. Uji fisiologis dan biokimia umum . Kultur yang dipergunakan untuk uji fisiologis dan biokimia ditumbuhkan pada media TSA atau TSB dan diinkubasi pada suhu ruang 29 ⁰C-30⁰C selama 24 jam bila tidak ada keterangan lain yang disebutkan secara khusus. Penggolongan tipe Gram sel yang diambil dari kultur umur 24 jam dilakukan menggunakan metode non-staining Buck, 1982 dan selanjutnya diverifikasi menggunakan metode pewarnaan Benson 2001 serta pengamatan pada perbesaran 1000 kali menggunakan mikroskop medan terang Olympus CH20BIMF200. Uji aktivitas katalase dilakukan dengan cara mengamati pembentukan gelembung pada 1 lup massa sel bakteri yang dicampur dengan 1-2 tetes H 2 O 2 3, sedangkan aktivitas oksidase diuji dengan menggunakan oxidase paper Difco. Aktivitas kitinolitik, proteolitik, dan amilolitik berturut-turut diobservasi pada kultur umur 7 hari yang tumbuh pada media 1 wv TSA yang mengandung 1 koloidal kitin, 1 susu skim, dan 1 soluble starch sedangkan aktivitas hidrolisis CMC Carboxy methyl cellulose di amati pada kultur yang tumbuh pada media agar CMC. Aktivitas pelarutan fosfat isolat terpilih diuji pada media agar Pikovskaya Pikovskaya, 1948. Tingkat toleransi terhadap NaCl diamati dengan cara menumbuhkan bakteri pada media kaldu LB yang mengandung NaCl pada berbagai konsentrasi 0-15. Penentuan pH pertumbuhan dilakukan dengan cara menumbuhkan bakteri pada media TSB yang telah diatur pH-nya menggunakan larutan NaOH atau HCl. Sedangkan penentuan suhu pertumbuhan dilakukan terhadap kultur cair bakteri yang diinkubasi pada suhu 13 ⁰C, 18⁰C, 20⁰C, 30⁰C, 37⁰C, 40⁰C, dan 42⁰C. Kultur untuk uji toleransi NaCl serta suhu dan pH pertumbuhan diinkubasi sambil digoyang pada kecepatan 75 rpm diatas shaker. Pertumbuhan kultur-kultur tersebut diamati dengan cara diukur rapat optisnya pada 600 nm. Selain uji-uji yang telah diuraikan diatas, uji fisiologis dan biokimia untuk isolat G062 juga dilakukan menggunakan kit API 20NE bioMerieux SA, Lyon, France.

b. Uji aktivitas fiksasi nitrogen. Aktivitas fiksasi nitrogen isolat terpilih

diuji dengan cara mengamati kemampuan tumbuh isolat yang diuji pada media agar LGI yang telah dimodifikasi K 2 HPO 4 0.2 gL; KH 2 PO 4 0.6 gL; MgSO 4 .7H 2 O 0.2 gL; CaCl 2 0.02 gL; Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0.002 gL; FeCl 3 0.01 gL; arabinosa 3 gL; manitol 3 gL; asam malat 3 gL; dan agar Bacto 15 gL dan uji aktivitas reduksi asetilen Acetylene reduction assay: ARA terhadap kultur yang tumbuh pada media semi padat LGI komposisi seperti agar LGI tetapi hanya mengandung agar Bacto 8 gL.