Uji aktivitas fiksasi nitrogen. Aktivitas fiksasi nitrogen isolat terpilih

pada ruang II pada two compartment petri disk. Sebagai pembanding, ruang I diisi kertas serap steril yang telah ditetesi 1 mL metil eugenol murni bersamaan dengan waktu inokulasi Ralstonia solanacearum Rs atau diiisi dengan media TSA dan digores dengan isolat endofit 10 hari lebih awal dari inokulasi R.solanacearum. Cawan ditutup kembali dengan rapat dan di-seal menggunakan plastic wrap untuk mencegah keluarnya senyawa volatil. Cawan cawan tersebut diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang dan kondisi gelap dan kemudian dipanen biomasa sel R. solanacearum-nya. Sebanyak 2 mL akuades ditambahkan ke dalam tabung berisi biomasa sel R. solanacearum kemudian divorteks berulang-ulang dengan kuat sampai membentuk suspensi dan tidak terlihat lagi gumpalan biomasa R.solanacearum. Suspensi disentrifuse pada 10000 rpm selama 10 menit. Pellet sel dikeringkan pada suhu 50ºC sampai diperoleh berat yang konstan ±2 hari. Supernatan yang mengandung EPS dipindahkan ke dalam wadah yang baru selanjutnya ditambah dengan etanol sebanyak 3 kali volume. Campuran tersebut disimpan pada freezer selama semalam, kemudian disentrifuse pada 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pellet EPS yang terbentuk dilarutkan kembali dalam akuades sebelum diukur kadar EPS-nya menggunakan metode fenol-asam sulfat sebagaimana yang dipublikasikan oleh Dubois et al. 1956. Uji pengaruh VOCs terhadap munculnya gejala layu bakteri pada planlet Isolat bakteri G053 ditumbuhkan dalam tabung reaksi kecil berisi agar TSA miring. Inokulasi TSA miring tersebut dilakukan secara aseptis pada posisi tabung terletak dalam suatu botol kultur kultur jaringan steril sehingga dinding luar tabung reaksi tidak tersentuh oleh tangan dan terjaga sterilitasnya. Tabung reaksi berisi kultur miring isolat G053 tersebut diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang dan gelap dalam tabung kultur jaringan yang tertutup sebelum dipindahkan ke dalam botol kultur jaringan yang berisi 3 planlet umur 2 minggu. Planlet diinkubasi kembali selama 4 hari, kemudian sebanyak 100 µL suspensi R. solanacerum ± 10 7 selmL di dalam akuades steril atau akuades steril sebagai perlakuan kontrol diteteskan ke media MS di sekitar akar plantlet. Planlet diinkubasi lagi sambil diamati timbulnya gejala layu selama selama 2 minggu setelah inokulasi patogen. Penyimpanan Isolat Isolat murni yang diperoleh diremajakan dan diperbanyak pada media TSA. Kultur padat isolat bakteri endofit yang tidak patogenik terhadap planlet kentang 119 isolat yang telah diremajakan umur 48-72 jam diambil menggunakan lup inokulasi kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah berisi 750 µL gliserol 40 steril. Tabung eppendorf tersebut ditutup rapat, diberi label dan selanjutnya divortex dengan kuat supaya terbentuk suspensi sel yang merata sebelum disimpan pada suhu -20 ⁰C. Penyimpanan jangka panjang juga dilakukan terhadap 4 isolat yang terpilih pada tahap seleksi awal G053, G062, G0196, dan L-12. Keempat isolat terpilih tersebut juga disimpan untuk jangka panjang dengan teknik liofilisasi freeze drying. HASIL DAN PEMBAHASAN Optimasi Prosedur Sterilisasi Permukaan Akar Sterilisasi permukaan merupakan tahapan penting dalam isolasi mikroba endofit. Penggunaan prosedur sterilisasi permukaan yang tepat dan efektif menjadi prasyarat penting yang harus dipenuhi dalam isolasi atau penelitian dengan bakteri endofit untuk menjamin isolat yang dihasilkan adalah true endophyte dan hasil penelitian tidak bias oleh keberadaan bakteri rizosfer dan filoplan. Rizosfer merupakan zona yang relatif kaya nutrien dan relatif tinggi variasi serta populasi mikrobanya Ahmad et al. 2008 sehingga akar mengalami paparan dan kontak yang lebih intensif dengan berbagai mikroba dibandingkan dengan bagian tanaman lainnya. Oleh karena itu diperlukan prosedur sterilisasi yang efektif untuk menyingkirkannya. Diantara keempat prosedur sterilisasi permukaan yang dilakukan terhadap sampel akar tanaman kentang varietas Granola asal Lembang, Garut, dan Cipanas, menunjukkan bahwa tidak ada koloni mikroba filoplan atau rizosfer yang tumbuh dari air bilasan terakhir asal prosedur IV ultrasonic cleaning diikuti dengan desinfeksi menggunakan 2.5 larutan bleaching komersial konsentrasi akhir setara dengan 1.3 NaOCl selama 3 menit kemudian dilanjutkan dengan etanol 75 selama 5 menit. Sedangkan rata-rata koloni bakteri yang tumbuh dari air bilasan terakhir asal prosedur III, II, dan I berturut-turut adalah 8.8, 5, dan 1.1 Gambar 8. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kombinasi perlakuan ultrasonic cleaning dengan dua desinfektan 1.3 larutan NaOCl dan etanol 75 merupakan prosedur sterilisasi akar yang yang paling efektif untuk mensterilkan permukaan sampel akar kentang dibandingkan tiga prosedur lainnya karena tidak ada koloni mikroba yang tumbuh Gambar 8. Rendahnya jumlah koloni bakteri yang tumbuh dari air bilasan terakhir asal prosedur III dan IV secara signifikan mengindikasikan bahwa ultrasonic cleaning mampu meningkatkan efektitivitas sterilisasi permukaan. Ultrasonic cleaning mampu melepaskan partikel kotoran yang melekat erat pada berbagai permukaan benda Dale 2009. Pada proses ultrasonic cleaning, partikel kotoran dilepaskan melalui mekanisme kavitasi yaitu microstreaming dan microstreamers lalu partikel kotoran yang sudah lepas dijauhkan melalui acoustic streaming turbulensi yang terkait dengan ultrasound. Lepasnya kompleks mikroba-partikel organik tanah yang lengket di permukaan akar meningkatkan penetrasi desinfetan ke relung-relung mikro micro niches yang terdapat pada permukaan bahan tanaman. NaOCl dan etanol banyak digunakan sebagai desinfektan dalam prosedur sterilisasi permukaan karena kedua sterilan ini relatif mudah diperoleh, murah, non toksik, serta tidak memerlukan penanganan khusus yang rumit.