endophyticus Bioesei produksi VOCs dan aktivitas penghambatannya terhadap kultur
Kemampuan kolonisasi bakteri ini cukup tinggi namun relatif lebih rendah dibandingkan M. endophyticus G053.
Berdasarkan berbagai karakter yang dimilikinya, M. endophyticus G053 sangat potensial dan ideal untuk dikembangkan sebagai agen hayati yang bersifat
multifungsi sebagai penginduksi ketahanan dan biokontrol vascular disease khususnya layu bakteri yang efektif serta sebagai agen pemacu pertumbuhan dan
produktivitas tanaman kentang. Sedangkan P. halophylus G062 lebih sesuai untuk dikembangkan sebagai agen hayati untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman
PGPB kentang. Kajian lebih lanjut tentang kombinasi dan formulasi kedua bakteri endofit tersebut tersebut perlu dilakukan untuk menghasilkan agen hayati
yang lebih unggul dan bersifat multifungsi.
DAFTAR PUSTAKA
huja I, Kissen R, Bones AM. 2011. Phytoalexins in defense against pathogens. Trend Plant Sci. 172: 73-101.
Ahmad F, Ahmad I, Khan MS. 2008. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiol Res.
163:173-181. Almagro L, Ros LVG, Belchi-Navarro S, Bru R, Barcelo AR, Pedren MA. 2009.
Class III peroxidases in plant defence reactions. J Experiment Bot. 602:377-390.
Andreote FD, da Rocha UN, Araujo WL, Azevedo JL, Overbeek LSV. 2010. Effect of bacterial inoculation, plant genotype and developmental stage on
root-associated and endophytic bacterial communities in potato Solanum tuberosum. Antonie van Leeuwenhoek. 97:389–399.
Asada K. 1999. The water–water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol. 50:601–639. Bailly A, Weisskopf L. 2012. The modulating effect of bacterial volatiles on
plant growth. Plant Signal Behav. 71:79-85. Benson HJ. 2001. Microbiological Application Laboratory Manual in. General
Microbiology. Brown AE ed. Bennett JW, Hung R, Lee S, Padhi S. 2012. Fungal and bacterial Volatile
Organic Compounds : an overview and their role as ecological signaling agents. The Mycota. 9: 373-393.
New York, US. Mc Graw Hill.
Boucher CA, Gough CL, Arlat M. 1992. Molecular genetics of pathogenicity determinants of Pseudomonas solanacearum with special emphasis on hrp
genes. Annu Rev Phytopathol. 30:443-461. Buddenhagen IW, Kelman A. 1964. Biological and physiological aspects of
bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum. Annu Rev Phytopathol. 2:203-230.
Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem. 72: 248-254. Buck JD. 1982. Nonstaining KOH method for determination of Gram reaction
of marine bacteria. App Environ Microbiol. 44:992-993. Burt S. 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential
applications in foods-a review. Int J Food Microbiol. 943:223–253. Caverzan A, Passaia G, Rosa SB, Ribeiro CW, Lazzarotto F, Pinheiro MM.
2012. Plant responses to stresses: role of ascorbate peroxidase in the antioxidant protection. Gene Molec Biol. 35:1011-1019.
Chaurasia B, Pandey A, Palni LMS, Trivedi P, Kumar B, Colvin N. 2005. Diffusible and volatile compounds produced by an antagonistic Bacillus
subtilis strain cause structural deformations in pathogenic fungi in vitro. Microbial Res. 160:75-81.
Chi Y, Y Yang, Y Zhou,J Zhou, B Fan, JQ Yu, Z Chen. 2013. Protein-protein interactions in the regulation of WRKY transcription factors. Molec Plant.
5:1-15. Chisholm ST, Coaker G, Day B, Staskawicz BJ. 2006. Host-microbe
interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cell. 124:803-814.
Choudhary DK, Johri BN. 2009. Interactions of Bacillus spp. and plants-with special reference to induced systemic resistance ISR. Microbiol Res.
1645:493-513. Clifford JMC, Scherf JM, Allen C. 2010. Ralstonia solanacearum Dps
contributes to oxidative stress tolerance and to colonization of and virulence on tomato plants. Appl Environ Microbiol. 7622: 7392–7399.
Compant S, Reiter B, Sessitsch A, Nowak J, Clement C, Barka EA. 2005. Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by Plant Growth-Promoting
bacterium Burkholderia sp. strain PsJN. Appl Environ Microbiol. 714:1685–1693.
Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C, Barka EA. 2005. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases : principles,
mechanisms of action, and future prospect. Appl Environ Microbiol. 719:4951–4959.
Denance N, Vallet AS, Goffner D, Molina A. 2013. Disease resistance or growth : the role of plant hormones in balancing immune responses and fitness
costs. Front Plant Sci. 4155. doi. 10.3389. Deslandes L, Pileur F, Liubert L, Boucher L, Arlat M. 2002. Resistance to
Ralstonia solanacearum in Arabidopsis thaliana in conferred by the recessive RRS1-R gene, a member of novel family of resistance gene. Proc
Natl Acad Sci. 99:2404-2409.
Dale E. 2009. Ultrasonics: Data, Equations, and Their Practical Uses, Volume 10. Boca Raton, Florida. CRC Press Taylor Francis Group.
Deng ZS, Zhao LF, Xu L, Kong
ZY, Zhao P, Qin
W, Chang JL, Wei GH. 2011. Paracoccus sphaerophysae sp. nov., a siderophore-producing, endophytic
bacterium isolated from root nodules of Sphaerophysa salsula. Intl J Syst Evol M
icrobiol.
61:665-669. Devi KP, Nisha SA, Sakthivel R, Pandian SK. 2010. Eugenol an essential oil of
clove acts as an antibacterial agent against Salmonella typhi by disrupting the cellular membrane. J Ethnopharmacol. 1301: 107–115.
Dimkpa CO, Merten D, Svatoš A, Büchel G, Kothe E. 2009. Metal-induced oxidative stress impacting plant growth in contaminated soil is alleviated by
microbial siderophores. Soil Biol Biochem. 411:154–162.
Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000. aiiA, a novel enzyme inactivates acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of
Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci 97:3526–3531. Dong YH, Zhang LH. 2005. Quorum sensing and quorum-quenching enzymes. J
Microbiol 43: 101-109. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 283:350-356.
Ergűn N, Topcuo ģlu SF, Yildiz A. 2002. Auxin Indole-3-acetic acid,
Gibberellic acid GA
3
, Abscisic Acid ABA and Cytokinin Zeatin production by some species of mosses and lichens. Turk J Bot. 26:13-18.
Faitlin F, Lottmann J, Grosch R, Berg G. 2004. Srategy to select and assess antagonistic bacteria for biological control of Rhizoctonia solani Kühn.
Can. J. Microbiol. 5010:811-820. Fernando WGD, Ramarathnam M, Krishnamoorthy AS, Savchuk SV. 2005.
Identification and use of potential bacterial organic antifungal volatiles in biocontrol. Soil Biol Biochem. 37:955964.
Ferreira A, Quecine MC, Lacava PT, Oda S, Azevedo JL, Araujo WL. 2008. Diversity of endophytic bacteria from Eucalyptus species seeds and
colonization of seedlings by Pantoea agglomerans. FEMS Microbiol Lett. 287: 8–14.
Flores-Mireles AL, Winans SC, Holguin G. 2007. Molecular characterization of diazotrophic and denitrifying bacteria associated with mangrove roots Appl
Environ Microbiol. 7322:7308–7321. Francis I, Holsters M, Vereecke D. 2010. The Gram-positive side of plant
microbe interactions. Environ Microbiol. 121:1-12. Genin S. 2010. Molecular traits controlling host range and adaptation to plants in
Ralstonia solanacearum. New Phytol. 187: 920–928. Glazebrook J. 2005. Contrasting mechanisms of defence against biotrophic and
necrotrophic pathogens. Annu Rev Phytopathol. 43:205-227Glick, BR. 2012. Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications.
Scientifica. 1-15.
Glickmann E, Dessaux Y. 1995. A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 61:793-796. Goldstein JI, Newbury DE, Echlin P, Joy DC, Romig AD Jr., Lyman CE, Fiori
C, Lifshin E. 1992. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologist, materials scientist, and cytologists 2
nd
edition. New York, USA, Plemun Press. Gothwal RK, Nigam VK, Mohan MK, Sasmal D, Ghosh P. 2008. Screening of
Nitrogen fixers from rhizospheric bacterial isolates associated with important dessertplants. Appl Ecol Environ Res. 62:101-109.
Grimault V, Prior P. 1993 Bacterial wilt resistance in tomato associated with tolerance of vascular tissues to Pseudomonas solanacearum. Plant Pathol.
42: 589–594. Gunawan OS. 2006. Virulensi dan ras Ralstonia solanacearum pada pertanaman
kentang di kecamatan Pangalengan, Kabupaten Bandung, Jawa Barat. J Hort. 163:211-218.
Gunawan OS, Smith EF. 1987. Survival of Pseudomonas solanacerum in the rhizosphere and non-rhizosphere of weeds and economic plant species.
Midelevation potato seminar proceedings. Lembang Indonesia, 15 January. Gupta RS. 2005. Protein signatures distinctive of alpha proteobacteria and its
subgroups and a model for alpha-proteobacterial evolution. Crit Rev Microbiol. 312:101-35.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta. PT. Gramedia Pustaka Utama.
Hallmann J, Berg G. 2006. Spectrum and population dynamics of bacteria root endophytes. In. Schulz BJC, Boyle CJC, Sieber TN eds.. Microbial Root
Endophytes. Berlin Heidelberg, Germany. Springer. Hallmann J, Hallmann A, Mahaffee WF, Kloepper JW. 1997. Bacterial
endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol. 4310: 895-914. Halim VA, S Altmann, D. Ellinger, L Eschen-Lippold, O Miersch, D Scheel, S
Rosahl. 2009. PAMP-induced defense responses in potato require both salycylic acid and jasmonic acid. The Plant J. 57:230-242.
Hayward AC. 1990. Diagnosis, distribution and status of groundnut bacterial wilt. In: Middleton KJ, Hayward AC eds. Bacterial Wilt of Groundnut. ACIAR
Proceddings 31. Heath MC. 2000. Hypersensitive response-related death. Plant Molec Biol.
443: 321-334. Hider RC, Kong X. 2010. Chemistry and biology of siderophores. Nat Product
Rep. 275: 637–657. Hirsch J, Deslandes L, Feng DX, Balague C, Marco Y. 2002. Delayed symptom
development in ein2-1, an arabidobsis ethylene insensitive mutant, in response to bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum.
Phytopathology. 92:1142-1148.
Höfling JF, Rosa EA, Baptista MJ, Spolidório DM. 1997. New strategies on molecular biology applied to microbial systematics. Rev Inst Med Trop Sao
Paulo. 396:345-52. Hoon KS, Cho HS, Cheong H, Ryu CM, Kim JF, Park SH. 2007. Two bacterial
endophytes eliciting both plant growth promotion and plant defense on pepper Capsicum annuum L. J Microbiol Biotechnol. 171 : 96-103.
Hu QP, Xu JG. 2011. A simple double-layered chrome azurol S agar SD- CASA plate assay to optimize the production of siderophores by a
potential biocontrol agent Bacillus. Afr J Microbiol Res. 525:4321-4327.
Jacobs JM, Babujee L, Meng F, Milling A, Allen C. 2012. The In Planta Transcriptome of Ralstonia solanacearum: Conserved Physiological and
Virulence Strategies during Bacterial Wilt of Tomato. mBio. 34: e00114- 12.
Jackson MT, Gonzalez LC. 1979. Persistence of Pseudomonas solanacearum in an inceptisol in Costa Rica In: Development in control of potato bacterial
diseases. Report of a planning conference, held by the International Potato Center. Apartado 5969. pp 66-71. Lima, Peru. 1979. 137 p.
Jie L et al. 2009. Artificial inoculation of banana tissue culture plantlets with indigenous endophytes originally derived from native banana plants. Bio
Control. 513:427-434. Jimtha JC, Smitha PV, Anisha C, Deepthi T, Meekha G, Radhakrishnan EK,
Gayatri GP, Remakanthan A. 2014. Isolation of endophytic bacteria from embryogenic suspension culture of banana and assessment of their plant
growth promoting properties. Plant Cell Tiss Organ Cult. 1181:57-66.
Kar M, Mishra D. 1976. Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescence. Plant Physiol. 57 2: 315-319.
Kavino M et al. 2007. Rhizosphere and endophytic bacteria for induction of systemic resistance of banana plantlets against bunchy top virus. Soil Biol
Biochem. 395:1087-1098. Kelman A. 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas
solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathol. 44:693-695.
Kim KS, Lee S, Ryu CM. 2013. Interspesific bacterial sensing through airborne signals modulates locomotion and drug resistance. Nat Commun. 41809.
Kim YC, Leveau J, Gardener BBMS,Pierson EA, Pierson LS III, Ryu CM. 2011. The multifactorial basis for plant health promotion by plant-associated
bacteria. Appl Environ Microbiol. 775: 1548–1555. Kloepper JW, Ryu CM. 2006. Bacterial endophytes as elicitors of induced
systemic resistance. Schulz BJE, Boyle CJC, Sieber TN eds. Microbial Root Endopphytes. Springer-Verlag, Berlin. p. 33-44.
Koch C, Rainey FA, Stackebrandt E. 1994. 16s rDNA studies on members of Arthrobacter and Micrococcus: an aid for their future taxonomic
restructuring. FEMS Microbiol Lett. 123: 167-172. Koste AY, Thomma BPHJ. 2013 The xylem as battleground for plant hosts and
vascular wilt pathogens. Front Plant Sci. 497:1-12. Krechel A, Faupel A, Hallmann J, Ulrich A, Berg G. 2002. Potato-associated
bacteria and their antagonistic potential towards plant-pathogenic fungi and the plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita Kofoid White
Chitwood. Can. J. Microbiol. 48:9 772-786.
Lambert RJ, Skandamis PN, Coote PJ, Nychas GJ. 2001 A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol
and carvacrol. J Appl Microbiol. 91:453-462. Lamminen MO, Walker HW, Weavers LK. 2004. Mechanisms and factors
influencing the ultrasonic cleaning of particle-fouled ceramic membrane. J Membrane Sci. 2371: 213–223.
Liu W, Mu W, Zhu B, Liu F. 2008. Antifungal activities and component of VOCs produced by Bacillus G8. Cur Res Biotechnol. 1:28-34.
Liu ZP, Wang BJ, Liu XY, Dai X, Liu YH, Liu SJ. 2008. Paracoccus halophillus sp. nov., isolated from marine sediment of the South China Sea,
China, and emended description of genus Paracoccus Davis 1969. Intl J Syst Evol Microbiol. 58:257-261.
Ludwig W. 2007. Nucleic acid techniques in bacterial systematics and identification. Int J Food Microbiol. 1203:225-36.
Lopez-Lopez A, Rogel MA, Omeho-Orrillo E, Martinez-Romero J, Martinez- Romero E. 2010. Phaseolus vulgaris seed-borne endophytic community
with novel bacterial species such as Rhizobium endophyticum sp. nov. Syst Appl Microbiol. 33:322-327.
Letoffé S, Audrain B, Bernier SP, Delepierre M, Ghigo JM. 2014. Aerial exposure to the bacterial volatile compound trimethylamine modifies
antibiotic resistance of physically separated bacteria by raising culture medium pH. mBio. 51:e00944-13.
Ma W, GA Berkowitz. 2011. Ca
2+
conduction by plant cyclic nucleotide gated channels and associated signaling components in pathogen defense signal
transduction cascades. New Phytol. 190 : 566-572. Machmud M. 2003. Bacterial wilt in Indonesia. In. Persley GJ ed. Bacterial Wilt
Disease in Asia and the South Pasific. Proc International Workshop, PCARRD-ACIAR, Philippines. ACIAR Proceedings 13:32-34.
Mano H, Morisaki H. 2008. Endophytic bacteria in rice plant. Microbes Environ. 232109-117.
Mansfield J, Genin S, Magori S, Citovsky C, Sriariyanum M, Ronald P, Dow M, Verdier V, Beer SV, Machado MA, Toth I, Salmond G, Foster GD. 2012.
Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 136:614-629.
Marchesi JR et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primer that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl
Environ Microbiol. 64: 795-799. Mavrodi DV, Gardener BBMS, Mavrodi DM, Bonsall RF, Weller DM.
Thomashow LS. 2001. Genetic diversity of phlD from 2,4- diacetylphloroglucinol-producing fluorescent Pseudomonas
spp. Phytopathology. 91: 35-43.
Meldau S, Erb M, Baldwin IT. 2012. Defence on demand : mechanisms behind optimal defence patterns. Ann Bot. 110: 1503-1514.
Milling A, Babujee L, Allen C. 2011. Ralstonia solanacearum extracellular polysaccharide is a specific elicitor of defense responses in wilt-resistant
tomato plants. PLoS One. 61:1-10. Munif A, Hallmann J, Sikora RA. 2012. Isolation of endophytic bacteria from
tomato and their biocontrol activities against fungal diseases. Microbiol Indones. 64:148-156.
Nakano Y, Asada K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate- specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22 5:
867-880. Naznin HA, Kiyohara D, Kimura M, Miyazawa M. M Shimizu, Hyakumachi M.
2014. Systemic resistance induced by Volatil Organics Compound emitted by Plant Growth-Promoting Fungi in Arabidopsis thaliana. PLOS ONE.
91: e86882-10.
Newman MA, Sundelin T, Nielsen JT, Erbs G. 2013. MAMP microbe- associated molecular pattern triggered immunity in plants. Front Plant
Sci. 4139: 1-14. O’Brien JA et al. 2012. A peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in
cultured Arabidopsis cells functions in MAMP-elicited defense. Plant Physiol. 158: 2013-2027.
Park SY, Lee SJ, Oh TK, Oh JW, Koo BT, Yum DY, Lee JK. 2003. AhlD, an N-acylhomoserine lactonase in Arthrobacter sp., and predicted
homologues in other bacteria. Microbiology. 149:1541–1550. Park HB, Lee B, Kloepper JW, Ryu CM. 2013. One shot-two pathogens blocked.
Exposure of Arabidopsis to hexadecane, a long chain volatile organic compound, confers induced resistance against both Pectobacterium
caratovorum and Pseudomonas syringae. Plant Signal Behav. 8:e24619-3.
Pavlo A, Leonid O, Iryna Z, Natalia K, Maria PA. 2011. Endophytic bacteria enhancing growth and disease resistance of potato Solanum tuberosum L.
Biol Control. 561: 43–49. Pieterse CMJ, Van Wees SCM, Van Pelt JA, Knoester M, Laan R, Gerrits H,
Weisbeek PJ, Van Loon LC. 1998. A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 10: 1571–1580.
Pieterse CMJ, Van Pelt JA, Van Wees SCM, Ton J, Leon-Kloosterziel KM, Keurentjes JJB, Verhagen BWM, Knoester M,Van der Sluis I, Bakker
PAHM, Van Loon LC. 2001. Rhizobacteria-mediated induced systemic resistance: triggering, signalling and expression. Eur J Plant Pathol.
107:51-61.
Poussier S, Thoquet P, Trigalet-Demery D. 2003. Host-plant dependent phenotypic reversion of Ralstonia solanacearum from non-pathogenic to
pathogenic forms via alteration in the phcA gene. Mol Microbiol. 49:991- 1003.
Poueymiro M, Genin S. 2009. Secreted proteins from Ralstonia solanacearum: a hundred tricks to kill a plant. Curr Opin Microbiol. 121:44-52.
Raaijmakers JM, Weller DM, Thomashow LS. 1997. Frequency of antibiotic- producing Pseudomonas spp. in natural environments. Appl Environ
Microbiol. 63 : 881-887. Rainey FA, Kelly DP, Stackebrandt E, Burghardt J, Hiraishi A, Katayama Y,
Wood AP. 1999. A re-evaluation of the taxonomy of Paracoccus denitrificans and a proposal for the combination Paracoccus pantotrophus
comb. nov. Intl J Syst Bacteriol. 49:645-651.
Robin A, MougelC, SiblotS, VansuytG, Mazurier S, Lemanceau P. 2006. Effect of ferritin overexpression in tobacco on the structure of bacterial and
pseudomonad communities associated with the roots. FEMS Microbiol Ecol. 583: 492–502.
Rosenblueth M, Romero EM. 2005. Bacterial Endophytes and Their Interactions with Hosts. MPMI. 198: 827–837.
Ross A, Yamada K, Hiruma K, Yamashita-Yamada M, Lu X, Takano Y, Tsuda K, Saijo Y. 2014. The Arabidopsis PEPR pathway couples local and systemic
plant immunity. The EMBO J. 331:62-74. Ryals JA, Neuenschwander UH, Willits MG, Molina A, Steiner HY, Hunt MD.
1996. Systemic Acquired Resistance. Plant Cell. 8:1809-1819. Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial
endiphytes : recent development and applications. FEMS Microbiol. Lett. 278:1-9.
Ryu CM, Farag MA, Hu CH, Reddy MS, Wei HX, Pare PW, Kloepper JW. 2003a. Bacterial volatiles promotes growth in Arabidopsis. Proc Natl
Acad Sci. 100:4927-4932. Ryu CM, Hu CH, Reddy MS, Kloepper JW. 2003b. Different signaling
pathways of induced resistance by rhizobacteria in Arabidopsis thaliana against two pathovars of Pseudomonas syringae. New Phytologist. 160:413-
420.
Ryu CM, Farag MA, Hu CH, Reddy MS, Kloepper JW, Pare PW. 2004. Bacterial volatiles induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Pathol
J. 134:1017-1026. Ryu, CM, Farag MA, Pare PW, Kloepper JW. 2005. Invisible signals from the
underground : bacterial volatiles elicit plant growth promotion and induce systemic resistance. Plant Pathol. J. 211:7-12.
Sasser MJ. 1990. Identification of bacteria through fatty acid analysis. in: Methods in Phytobacteriology. Z. Klement, K. Rudolph, and D. Sands eds.
Akademiai Kiado, Budapest. p. 199-204. Sastra DR. Masa inkubasi bakteri patogenik Ralstonia solanacearum ras 3 pada
beberapa klon kentang. J Agron. 81: 63-67.
Schulz B, Boyle C. 2006. What are endophytes ? Schulz BJE, Boyle CJC, Sieber TN eds. Microbial Root Endopphytes. Springer-Verlag, Berlin. p. 1-13.
Sessitsch A, Reiter B, Berg G. 2004. Endophytic bacterial communities of field- grown potato plants and their plant growth-promoting abilities. Can J
Microbiol. 504:239-249. Siddiquee S, BE Cheong, K Taslima, H Kausar, Md M Hasan. Separation and
identification of volatile compounds from liquid cultures of Trichoderma harzianum by GC-MS using three different capillary columns. J Chrom Sci.
50:358-367.
Siriwan R, Chantra I, Pavinee S, Worarat K, Ratchaniwan J, Arinthip T. 2012. Plant growth enhancing effects by a siderophore-producing endophytic
streptomycete isolated from a Thai jasmine rice plant Oryza sativa L. cv. KDML105.
Antonie van Leeuwenhoek. 1023: 463. Snavely
JG, Brahier J. 1960. The viability of streptococci under field screening conditions. Amer J Clin Path. 33: 511-515.
Soesanto L, Mugiastuti E, Rahayuniati RF. 2011. Inventarisasi dan identifikasi patogen tular-tanah pada pertanaman kentang di Kabupaten Purbalingga. J
Hort. 213:254-264. Song GC, Ryu CM. 2013. Two volatile organic compounds trigger plant self
defense against a bacterial pathogen and a sucking insect in Cucumber under open field conditions. Int J Mol Sci. 14:9803-9819.
Stackebrandt E, Koch C, Gvozdiak O, Schumann P. 1995. Taxonomic dissection of the genus Micrococcus: Kocuria gen. nov., Nesterenkonia gen. nov.,
Kytococcus gen. nov., Dermacoccus gen. nov., and Micrococcus Cohn 1872 gen. emend. Int J Syst Bacteriol 45:682– 692.
Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, Gouzy J, Mangenot S, Ariat M, Billault A, Brottier P, Camus JC. 2002. Genome sequence of the plant
pathogen Ralstonia solanacearum. Nature. 415: 497–502. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol
28:2731-2739.
Tans-Kersten J, Huang H, Allen C. 2001. Ralstonia solanacearum needs motility for invasive virulence on tomato. J Bacteriol. 183:3597-3065.
Thomma BPHJ, T Numberger, MHAJ Joosten. 2013. Of PAMPs and effectors : The Blurred PTI-ETI dichotomy. The Plant Cell. 23:4-15.
Thomas P, Soly TA. 2009. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana Musa sp. cv. Grand Naine and the affinity of endophytes to
the host. Microb Ecol. 58:952-964. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighing, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22:4673-4680.
Tran LT, Taylor JS, Constabel CP. 2012. The Polyphenol oxidase gene family in land plants: lineage-specific duplication and expansion. BMG Genomics.
13395:1471-2164. Tsavkelova EA, Klimova SY, Cherdyntseva TA, Netrusov AI. 2006. Microbial
producers of plant growth stimulators and their practical use : A review. Appl. Biochem Microbiol. 422:117-126.
Uroz S, dAngelo C, Carlier A, Elasri M, Sicot C, Petit A, Oger P, Faure D, Dessaux Y. 2003. Novel bacteria degrading N-acyl homoserine lactones
and their use as quenchers of quorum-sensing regulated functions of plant pathogenic bacteria. Microbiology. 149: 1981–1989.
Vallad GE, Goodman RM. 2004. Systemic acquired resistance and induced systemic resistance in conventional agriculture. Crop Sci. 44:1920-1934
Van Soest PJ, Robertson JB, Lewis BA. 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal
nutrition. J Dairy Sci. 74:3583–3597. Vansuyt G, Robin A, Briat JF, Curie C, Lemanceau P. 2007. Iron acquisition
from Fe-pyoverdine by Arabidopsis thaliana. Mol Plant Microb Interact. 204: 441–447.
Van Weest SCM, De Swart EAM, Van Petl JA, Van Loon LC, Pieterse CMJ. 2000. Enhancement of induced diseas3e resistance by simultaneous
activation of salicylate-and jasmonat-dependent defense pathways in Arabidopsis thaliana. PNAS. 9715:8711-8716.
Vasse J, Frey P, Trigalet A. 1995. Microscopic studies of intercellular infection and protoxylem invasion of tomato roots by Pseudomonas
solanacearum. Mol. Plant Microbe Interact. 8: 241–251. Verma JP, J Yadav, KN Tiwari, Lavakush, and V Singh. 2010. Impact of plant
growth promoting Rhizobacteria on crop production. Intl J Agric Res. 511 : 954-983.
Wang KLC, Li H, Ecker JR. 2002. Ethylene biosynthesis and signaling networks. The Plant Cell. 14:131-151.
Weingart H, Volksch B. 1997. Ethylene production by Pseudomonas syringae pathovars in vitro and in planta. Appl Environ. Microbiol. 631:156-161.
Wu G, Shortt BJ, Lawrence EB, Levine EB, Fitsimmons KC. 1995. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H
2
O
2
generating glucose oxydase in transgenic potato plants. The Plant Cell. 7:1357-1368.
Xu J, Lin X, Luo L. 2012. Effect of engineered Sinorhizobium meliloti on cytokinin synthesis and tolerance of Alfalfa to extreme drought stress. Appl
Environ Microbiol. 78:8056-8061. Zamioudis C and CMJ Pieterse. 2012. Modulation of host immunity by
beneficial microbes. MPMI. 252:139-150.
LAMPIRAN
Lampiran 1. Lokasi pengambilan contoh tanaman di Pasir Wangi Garut
Lampiran 2. Isolat Bakteri Endofit Kentang Asal Lembang No
. Kode Isolat
1 L-01
2 L-02
3 L-03
4 L-09
5 L-10
6 L-11
7 L-12
Lampiran 3. Isolat Bakteri Endofit Kentang Asal Garut
No. Kode Isolat
No. Kode Isolat
No. Kode Isolat
1 G001
38 G064
75 G132
2 G002
39 G066
76 G133
3 G003
40 G067
77 G137
4 G004
41 G068
78 G138
5 G007
42 G069
79 G140
6 G012
43 G071
80 G141
7 G014
44 G072
81 G146
8 G015
45 G075
82 G147
9 G018
46 G079
83 G149
10 G021
47 G081
84 G152
11 G022
48 G082
85 G153
12 G025
49 G085
86 G154
13 G028
50 G087
87 G155
14 G029
51 G088
88 G157
15 G030
52 G091
89 G158
16 G032
53 G095
90 G159
17 G033
54 G097
91 G160
18 G034
55 G102
92 G161
19 G035
56 G103
93 G163
20 G037
57 G104
94 G164
21 G039
58 G105
95 G165
22 G040
59 G107
96 G167
23 G041
60 G108
97 G173
24 G043
61 G109
98 G174
25 G045
62 G112
99 G176
26 G047
63 G114
100 G177
27 G049
64 G115
101 G178
28 G050
65 G116
102 G181
29 G051
66 G118
103 G182
30 G053
67 G119
104 G183
31 G054
68 G120
105 G184
32 G055
69 G121
106 G187
33 G056
70 G124
107 G188
34 G059
71 G125
108 G191
35 G060
72 G126
109 G193
36 G062
73 G127
110 G196
37 G063
74 G130
111 G199
112 G202
Lampiran 4 Hasil analisa kadar lignin tanaman Perlakuan
Lignin Kontrol
33.30 Kontrol + R. solanacearum
24.32 G053
31.28 G053 + R. solanacearum
38.38
Lampiran 5 Trapping VOCs yang diemisikan oleh M. endophyticus G053
Lampiran 7. Foto uji kualitatif produksi IAA oleh isolat G053 dan G062
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Jepara pada tanggal 8 Desember 1968, sebagai anak dari Bapak HA Zainuri Basri dan Ibu Hj. Zulichah. Pada tahun 1995 penulis menikah
dengan Iman Rusmana. Dari pernikahan tersebut penulis dikaruniai 4 orang anak bernama Zul Fadhli, Kamila Nur Imani Putri, Fadhila Nur Imani Putri, dan Zaki
Aulady.
Pendidikan Sarjana diselesaikan oleh penulis di Jurusan Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor IPB pada tahun 1994. Gelar Magister Sains dalam
bidang Mikrobiologi diraih oleh penulis dari Program Pasca Sarjana IPB pada tahun 2000. Selanjutnya pada tahun 2009 diterima sebagai mahasiswa S3 pada
mayor Mikrobiologi Sekolah Pasca Sarjana IPB. Penulis bekerja sebagai peneliti pada Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian, Badan Litbang Pertanian, Kementrian Pertanian Republik Indonesia. Pada tahun 2007 sampai 2009, penulis terlibat sebagai tim pengajar
mata kuliah Mikrobiologi Dasar di Program Diploma IPB. Penulis menerima PhD research grant dari SEAMEO BIOTROP pada tahun 2012 dengan No.
kontrak 047.22PSRPST-PNLTIII2012.
Penulis telah mempresentasikan sebagian dari penelitian disertasi sebagai poster pada First SEAMEO BIOTROP International Conference on Enhancing
and Promoting the Real Values of Tropical Biodiversity of Southeast Asia yang diselenggarakan di Bogor pada tahun 2013 dengan judul “Exploration of
Endophytic Bacteria Enhancing Potato Seedling Resistance against Bacterial Wilt”. Penelitian disertasi tersebut sebagian telah diterima Hayati Journal of
Biosciences sebagai materi publikasi dengan judul “Characterization of an Endophytic Bacterium G062 Isolate with Beneficial Traits” dan sebagian telah di-
submit ke Journal of Phytopathology dengan judul “Enhancement of Potato Seedling Growth and Resistance Against Bacterial Wilt by Micrococcus
endophyticus G053 Producing Volatile Organic Compounds”.
Bogor, Juli 2014
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kentang Solanum tuberosum Linn. merupakan bahan makanan pokok di dunia setelah beras, gandum, dan jagung. Kentang juga merupakan salah satu
komoditas hortikultura yang memiliki harga yang cukup tinggi dalam perdagangan domestik maupun internasional. Kebutuhan kentang nasional terus
meningkat seiring dengan peningkatan populasi dan pendapatan penduduk serta industri pengolahan makanan. Dalam rangka memenuhi kebutuhan kentang
nasional, pemerintah menjadikan kentang sebagai salah satu prioritas pengembangan komoditas hortikultura nasional. Upaya peningkatan produksi
kentang di Indonesia menghadapi berbagai kendala diantaranya serangan hama penyakit serta kualitas bibit kentang yang rendah. Layu bakteri merupakan
penyakit penting pada budidaya kentang. Penyakit ini disebabkan oleh bakteri patogen Ralstonia solanacearum. Bakteri ini merupakan bakteri fitopatogen
paling merusak di seluruh dunia karena keragamannya yang sangat tinggi terkait dengan asal geografis dan inangnya Genin 2010. Survey yang dilakukan
terhadap 458 anggota komunitas internasional bacterial pathologist bekerjasama dengan Jurnal Molecular Plant Pathology menempatkan R. solanacearum pada
peringkat kedua setelah P. syringae untuk kategori bakteri fitopatogen yang penting secara ilmiah dan ekonomi Mansfield et al. 2012.
Kehilangan hasil yang disebabkan oleh penyakit layu bakteri di wilayah Sumatera, Jawa, Bali, Lombok, dan Sulawesi berkisar 15-95 Machmud
2005. Survei dan inventarisasi patogen tular-tanah di lahan pertanaman kentang di Kabupaten purbalingga yang dilakukan pada tahun 2008-2009 menunjukkan
persentase populasi R. solanacearum mencapai 71.6 dan menempati peringkat pertama dari 7 spesies mikroba fitopatogen tular-tanah R. solanacearum,
Fusarium oxysporum, F. solani, Curvularia sp. Phytophtora infestans, Helminthosporium purpureum, Pseudomonas berpendar yang ditemukan
Soesanto et al. 2011. Pada umumnya petani kentang mengaplikasikan pestisida sintetik untuk melindungi tanamannya dari serangan penyakit. Namun aplikasi
pestisida sintetik secara tidak rasional dan berlebihan dalam jangka panjang menimbulkan masalah serius bagi lingkungan dan meningkatkan residu dalam
umbi kentang.
Bibit yang bebas patogen, tahan penyakit, dan memiliki produktivitas yang tinggi merupakan kriteria untuk bibit kentang berkualitas tinggi. Produksi bibit
kentang yang berkualitas tinggi dalam skala besar dilakukan dengan teknologi perbanyakan in vitro kultur jaringan. Perbanyakan secara in vitro dilakukan pada
kondisi yang steril dan terkontrol. Sebagai konsekuensinya, bibit tanaman yang dihasilkan banyak kehilangan mikroorganisme berguna yang turut berperan dalam
pertumbuhan dan ketahanan tanaman terhadap patogen. Inokulasi dini bakteri endofit akan meningkatkan ketahanan bibit tanaman hasil kultur in vitro terhadap
cekaman biotik dan abiotik. Selain itu, kemampuan bakteri endofit untuk hidup dan berkembang di dalam jaringan tumbuhan dapat melindungi tanaman inang
dari kolonisasi dan dominansi fitopatogen yang berhasil masuk ke dalam jaringan tanaman.
Berbagai hasil penelitian di luar negeri yang berkaitan dengan eksplorasi dan eksperimen aplikasi bakteri endofit sebagai agensia biokontrol fitopatogen
pada bibit dan tanaman telah banyak dilaporkan Andreotte et al. 2010; Hoon et al. 2007. Namun demikian, studi tentang aplikasi bakteri endofit pada planlet
dan pengaruhnya terhadap ketahanan bibit kentang terhadap penyakit belum pernah dilaporkan di Indonesia. Oleh karena itu, eksplorasi karakterisasi, dan
percobaan aplikasi bakteri endofit dari Indonesia sangat penting untuk dilakukan, karena sebagai negara tropis Indonesia memiliki kondisi dan iklim yang berbeda.
Tujuan
Secara umum penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan bakteri endofit yang efektif untuk meningkatkan ketahanan tanaman kentang
terhadap penyakit layu bakteri. Tujuan umum tersebut dicapai melalui beberapa tahap penelitian dengan tujuan khusus untuk :
1. Mengisolasi dan menapis bakteri endofit yang efektif untuk meningkatkan
ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum.
2. Mengamati kemampuan kolonisasi isolat bakteri endofit terpilih pada planlet dan tanaman kentang.
3. Menguji kemampuan bakteri endofit terpilih dalam menghasilkan Volatile Organic Compounds VOCs yang berperan dalam meningkatkan ketahanan
tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri 4. Mengkarakterisasi isolat bakteri endofit yang terpilih.
Manfaat Penelitian
1. Memberikan kontribusi informasi ilmiah bagi penelitian dan pengembangan agen hayati untuk penyakit layu bakteri yang baik dan unggul di Indonesia
2. Tersedianya kandidat agen hayati yang terkarakterisasi dengan baik serta memiliki kemampuan tinggi dalam meningkatkan pertumbuhan serta
resistensi dan atau melindungi tanaman kentang dari penyakit layu bakteri. 3. Meeningkatan kualitas dan produktivitas bibit kentang.
Kerangka Pemikiran
R. solanacearum merupakan bakteri fitopatogen yang memiliki kisaran inang yang sangat luas dan menjadi masalah di negara-negara subtropis maupun
tropis. Karakter R. solanacearum yang menjadikan jaringan xilem sebagai sasaran aktivitas patogeniknya serta persistensinya yang tinggi ketika berada di
tanah menjadikannya sulit dikendalikan. Pemanfaatan bakteri endofit sebagai agen hayati untuk meningkatkan ketahanan tanaman sekaligus mengendalikan
fitopatogen ini merupakan alternatif strategi yang baik dan tepat karena kedua jenis bakteri ini memiliki relung ekologi yang sama tetapi memiliki karakter yang
berbeda.
Indonesia sebagai salah satu negara “Mega biodiversity” memiliki potensi keragaman mikroba endofit yang sangat tinggi. Oleh karena itu kegiatan
eksplorasi untuk mendapatkan bakteri endofit jenis baru atau yang memiliki karakteristik baru seperti penghasil VOCs serta pengkajian potensinya untuk
meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit seperti layu bakteri perlu
dilakukan. Isolasi bakteri endofit, penapisan, interaksi isolat terpilih dengan tanaman inang dan Ralstonia solanacearum, kemampuan kolonisasi, serta
karakter-karakter isolat terpilih perlu dikaji secara seksama untuk mendapatkan kandidat agen hayati yang efektif, unggul, dan aman untuk meningkatkan
ketahanan tanaman terhadap penyakit ini.
Novelty
Hasil penelusuran yang telah dilakukan menunjukkan bahwa sampai saat ini belum ada laporan dari dalam atau luar negeri tentang kajian pemanfaatan bakteri
endofit yang menghasilkan Volatile Organic Compounds VOCs untuk meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri yang
disebabkan oleh R. solanacearum. Pemanfaatan bakteri penghasil VOCs sebagai agen penginduksi ketahanan tanaman merupakan salah satu topik riset dalam
bidang mikrobiologi dan fitopatologi yang baru dalam kurun waktu 10 tahun terakhir. Oleh karena itu penemuan jenis-jenis bakteri baru, mode of action baru,
atau dengan potensi menghasilkan senyawa-senyawa volatil dengan jenis atau komposisi baru, berpotensi besar untuk dimanfaatkan dan dikembangkan sebagai
agen untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit.
Hipotesis
1. Terdapat sejumlah bakteri endofit kentang yang efektif dalam meningkatkan ketahanan dan melindungi bibit kentang terhadap penyakit layu bakteri yang
disebabkan oleh R. solanacearum.
2. Efektivitas bakteri endofit dalm meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap R. solanacearum melibatkan berbagai senyawa bioaktif antara lain
Volatile Organic Compounds VOCs.
3. Isolat bakteri endofit yang diperoleh mampu mengkolonisasi jaringan bibit tanaman kentang untuk melindunginya dari serangan penyakit layu bakteri.
Kerangka Penelitian
Berdasarkan tujuan dan hipotesis penelitian yang telah dipaparkan sebelumnya, dirancang suatu penelitian dengan tahapan-tahapan sebagai berikut
Gambar 1 : 1.
Isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang 2.
Penapisan isolat bakteri endofit yang mampu meningkatkan ketahanan tanaman kentang terhadap penyakit layu bakteri
3. Telaah respon fisiologis inang yang berkaitan dengan ketahanan
4. Uji kemampuan kolonisasi bakteri endofit kentang terpilih
5. Karakterisasi isolat bakteri endofit kentang terpilih
TINJAUAN PUSTAKA Ralstonia solanacearum Penyebab Penyakit Layu Bakteri
R. solanacearum adalah bakteri Gram negatif yang semula dikenal sebagai Pseudomonas solanacearum. Bakteri ini termasuk dalam kelompok beta
Proteobacteria Sequira,1992. Ralstonia solanacearum merupakan patogen penting pada tanaman kentang. Bakteri ini menyerang akar tanaman melalui luka
yang diantaranya disebabkan oleh munculnya akar lateral. Di dalam tanaman inang yang rentan, bakteri ini berkembang biak dengan cepat di jaringan korteks
untuk selanjutnya menyerang bagian xylem. Dalam beberapa jam, terjadi kolonisasi R. solacearum secara agresif di tabung xylem, lalu melalui sistem
jaringan pembuluh menyebar ke bagian tajuk dan batang mengikuti aliran transpirasi dan akhirnya menyebabkan kelayuan yang mematikan. Gejala penyakit
layu bakteri meliputi kekuningan dan layu, diikuti dengan nekrosis dan kematian tanaman Vasse et al. 1995; Tan-Kersten et al. 2001.
R. solacearum adalah salah satu patogen tanaman yang sulit dikendalikan karena bakteri ini memiliki kisaran inang yang luas. Lebih dari 200 famili
tumbuhan telah diketahui sebagai inang R. solacearum Hayward, 1990. Di daerah penanaman kentang di Pangalengan Jawa Barat telah diketahui lebih dari
70 gulma yang menjadi inang R. solacearum Gunawan, 2006. Selain itu, bakteri ini memiliki persistensi yang tinggi di dalam tanah walaupun tanpa tanaman inang
Jackson dan Gonzales, 1979.
Genom R. solanacearum strain tropis GMI1000 terdiri dari 1 kromosom sirkuler berukuran 3.7 Mb dan 1 megaplasmid berukuran 2.1 Mb. Megaplasmid
mengandung gen-gen yang berperan penting untuk kebugaran dan kemampuan adaptasi bakteri ini pada berbagai kondisi serta semua gen hrp yang diperlukan
dalam proses kolonisasi relung ekologi spesifik serta patogenesis. Analisis sekuen genom menunjukkan keberadaan struktur mozaik yang membuktikan adanya gen-
gen yang diperoleh dari transfer gen secara horizontal. Ada 10 gen yang diduga terlibat dalam detoksifikasi ROS, 6 gen haemolysin-like, beberapa gen peptide
atau polyketide synthase, gen toxin syringomycin synthase, gen pengkode protein pelekat AttM dan AttZ, serta puluhan gen yang terkait dengan biogenesis dan
struktur berbagai pili. Tingginya jumlah dan variasi gen pengkode pili serta faktor pelekat lainnya sangat mendukung kemampuan adaptasi yang tinggi dari bakteri
ini Salanoubat et al. 2002. Berdasarkan analisis genom, diperkirakan patogen ini mengekresikan ratusan protein yang berperan sebagai efektor dalam proses
patogenisitasnya terhadap inang Poueymiro dan Genin 2009.
Bakteri Endofit
Deskripsi awal tentang mikroorganisme nonpatogenik dalam jaringan akar tanaman pertama kali dilaporkan oleh Perotti pada 1926 dan berikutnya Hennig
dan Villforth pada tahun 1940 melaporkan keberadaan bakteri di dalam 28 jenis daun, batang, dan akar tanaman sehat. Namun penelitian tentang bakteri endofit
pada berbagai tanaman mulai banyak dilakukan sejak Hollis dari Universitas Nebraska USA melaporkan keberadaan bakteri endofit pada tanaman kentang
Mano dan Morisaki 2008. Bakteri endofit didefinisikan sebagai bakteri yang dapat diisolasi dari dalam jaringan tanaman atau dari jaringan yang telah
disterilisasi permukaannya serta tidak membahayakan tanaman Hallmann et al. 1997.
Dewasa ini, perkembangan bidang mikrobiologi dan bioteknologi telah membuktikan bahwa keberadaan bakteri endofit berperan penting bagi
pertumbuhan dan ketahanan tumbuhan terhadap cekaman biotik dan abiotik. Beberapa bakteri endofit diketahui dapat berperan sebagai penambat nitrogen,
penghasil fitohormon, biokontrol patogen, serta penginduksi ketahanan tumbuhan terhadap cekaman biotik dan abiotik Andreotte et al. 2010, Mano dan Morisaki
2008. Penemuan bakteri endofit yang mampu menambat nitrogen pada tanaman gramineae pada tahun 1980 telah memicu berbagai penelitian tentang aplikasi
bakteri endofit yang mampu menambat nitrogen pada tanaman-tanaman tidak berbintil dari golongan serealia diantaranya padi.
Bakteri endofit juga terbukti berperan dalam meningkatkan pasokan Fe bagi tanaman inang. Percobaan inplanta menggunakan bakteri endofit
Streptomyces sp. GMKU 3100 dan mutan gen desD-like penyandi enzim kunci pada akhir lintasan biosintesis siderofor membuktikan bahwa tanaman padi dan
kacang hijau yang diinokulasi Streptomyces sp. GMKU 3100 tipe liar memiliki biomasa tanaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan dengan tanaman yang
diinokulasi dengan Streptomyces sp. GMKU 3100 mutan Siriwan et al. 2012. Sebelumnya, Dimkpa et al. 2009 juga telah mempublikasikan hasil
penelitiannya yang membuktikan bahwa pemberian supernatan bebas sel Streptomyces sp. tipe liar pada tanaman kacang tunggak cowpea dapat
meningkatkan penyerapan Fe, kadar klorofil, dan menghindari efek peroksidasi lemak pada daun walaupun ditanam pada media tanam yang mengandung
Al, Cu, Mn, Ni dan U dalam konsentrasi cukup tinggi. Pemberian siderophore tersebut
juga menurunkan pembentukan radikal bebas sehingga melindungi auksin yang diproduksi mikroba dari degradasi dan pada akhirnya dapat meningkatkan
pertumbuhan tanaman. Uji penyerapan kompleks Fe-pyoverdin menggunakan tanaman kacang hijau juga membuktikan bahwa tanaman mampu menyerap
komplek tersebut Vansuyt et al. 2007. Percobaan menggunakan tanaman tembakau transgenik over ekspresi ferritin menunjukkan bahwa kadar Fe pada
tanaman transgenik lebih tinggi dibandingkan tanaman non-transgeniknya Robin et al. 2006. Hasil-hasil penelitian tersebut secara tidak langsung membuktikan
bahwa selain meningkatkan penyerapan Fe, ekspresi siderofor di dalam jaringan tanaman juga tidak berbahaya bagi tanaman.
Kemampuan bakteri endofit dalam melarutkan fosfat diduga juga berperan dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Selain meningkatkan ketersedian
nutrisi seperti Nitrogen Fe, dan Fosfat untuk tumbuhan, berbagai senyawa bioaktif seperti fitohormon dan vitamin yang diproduksi oleh beberapa bakteri endofit juga
berguna dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman inangnya Ryan et al. 2008; Tsavkevlova et al. 2006; Rosenblueth dan Romero 2006.
Peran Bakteri Endofit dalam Meningkatkan Ketahanan Tanaman
Tumbuhan memiliki sistem imunitas basal dan respon pertahanan berlapis yang dapat di picu secara sistematik untuk menurunkan tingkat kejadian dan
keparahan penyakit. Berdasarkan agen penginduksinya, sistem resistensi pada tumbuhan dapat dibedakan atas Systemic Acquired Resistance SAR dan Induced
Systemic Resistance ISR. Infeksi patogen akan mengaktifkan sistem ketahanan
tumbuhan yang akan melindunginya dari berbagai mikroorganisme broad spectrum untuk jangka panjang. Ketahanan tumbuhan yang timbul akibat infeksi
patogen ini dikenal sebagai Systemic Acquired Resistance SAR Francis et al. 2010. Lintasan SAR bersifat salicylic acid SA dependent Choudhary dan Johri
2009; Kloepper dan Ryu 2006 Gambar 5. Sebagai respon terhadap patogen, tumbuhan akan memproduksi reactive oxygen species ROS, protein-protein
terkait patogenesis PR- proteins, penebalan dinding-dinding sel, serta produksi fitoaleksin. Fitoaleksin adalah metabolit sekunder berberat molekul rendah yang
memiliki aktivitas antimikroba. Kelompok senyawa ini merupakan salah satu marka untuk ketahanan tumbuhan terhadap penyakit. Berbagai fitoaleksin telah
berhasil diisolasi dan didentifikasi dari berbagai tumbuhan, namun sampai saat ini mekanisme dan lintasan biosintesisnya belum diketahui dengan pasti. Capsidiol
dan scopoletin adalah senyawa fitoaleksin utama yang dihasilkan oleh tumbuhan Solanaceae. Ahuja et al. 2011.
Berbeda dengan SAR yang diaktifkan oleh patogen, ISR dapat diaktifkan diantaranya oleh kolonisasi bakteri kelompok Plant Growth Promoting PGP
Francis et al. 2010. Sebagian besar laporan penelitian menunjukkan bahwa ISR diinduksi oleh strain-strain bakteri akar yang hidup bebas. Tetapi akhir-akhir ini
berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri endofit juga dapat merangsang Induced Systemic Resistance ISR sebagaimana kelompok bakteri
PGP Jimtha et al. 2014; Choudhary dan Johri 2009; Ryan et al. 2008; Compant et al. 2005. Berbeda dengan SAR yang bersifat salicylic acid SA dependent,
lintasan ISR bersifat salicylic acid SA independent dan etilen ET dependent Choudhary dan Johri 2009; Kloepper dan Ryu 2006; Vallad dan Goodman 2004;
Pieterse et al. 1998 Gambar 2.
Gambar 2. Lintasan induksi resistensi tanaman oleh bakteri patogen dan rhizobacteria Vallad dan Goodman 2004.
Analisa transkriptomik pada tanaman A. thaliana yang diinokulasi secara ganda menggunakan bakteri akar non-fitopatogenik P. fluorescens WCS417r dan
P. syringae pv. tomato DC3000 membuktikan bahwa aktivasi lintasan SAR dan ISR dapat terjadi secara paralel. Berdasarkan hasil analisa transkriptomik tersebut
dibuat suatu model hipotetik lintasan aktivasi paralel SAR dan ISR Gambar 3 Saskia et al. 2000. Hasil-hasil penelitian menggunakan metode transkriptomik,
genetika molekuler, dan proteomik yang dilakukan oleh peneliti-peneliti berikutnya Chi et al. 2013; Ma dan Berkowitz 2011; Thomma et al. 2011
memperkuat bukti yang mendukung model hipotetik yang disusun oleh Saskia et al. 2006. Model hipotetik tersebut menghilangkan dikotomi yang kaku antara
lintasan ISR dan SAR. Selain itu, walaupun sederhana model ini juga mengakomodir kemungkinan peran ganda dari senyawa-senyawa dan atau protein
pada kedua lintasan resistensi tersebut serta kompleksitas hubungan berbagai senyawa dan atau protein yang terlibat di dalamnya.
Gambar 3 Model induksi ISR dan SAR secara paralel Saskia et al. 2000 Flagelin, lipopolosakarida, asam salisilat, siderofor, pyochelin, pyocianin,
dan senyawa volatil 2,3-butanediol merupakan contoh komponen sel atau senyawa yang dihasilkan bakteri yang mampu menginduksi ketahanan tanaman
Tabel 1 Choudhary dan Johri 2009; Compant et al. 2005; Ryu et al. 2005. Selain berperan dalam merangsang ketahanan tanaman, sebagian diantara
senyawa-senyawa tersebut juga berperan ganda sebagai faktor pengendali patogen Ryan et al. 2008 dalam mekanisme biokontrol. Mekanisme biokontrol
oleh bakteri endofit mirip dengan mekanisme biokontrol oleh populasi bakteri rizosfer dan epifit yaitu melalui kompetisi kolonisasi relung ekologi dan atau
nutrisi yang sama dengan pathogen serta produksi senyawa-senyawa allelokimia diantaranya siderofor, antibiotik, biocidal volatiles, enzim-enzim pendegradasi,
dan atau senyawa pendetoksifikasi Chernin et al. 2011; Compant et al. 2005; Francis et al. 2010.
Tabel 1. Beberapa senyawa dan determinan bakteri penginduksi ketahanan pada beberapa tumbuhan Chodhary dan Johri 2009
Strain Bakteri Spesies
Tumbuhan Senyawa atau
Determinan
B. amyloliquefaciens IN937a Arabidopsis
2,3-butenadiol B. subtilis GB03
Arabidopsis 2,3-butenadiol
Kacang polong SA
Tembakau SA
Tomat Pyocelin pyocyanin
P. fluorescens CHA0 Arabidopsis
2,4 DAPG Tembakau
Siderofor Tomat
2,4 DAPG P. fluorescens Q2-87
Arabidopsis 2,4 DAPG
P. fluorescens WCS 374 Lobak
LPS Siderofor Fe regulated compouns
P. fluorescens WCS 417 Arabidopsis
LPS Carnation
LPS Lobak
LPS Fe regulated compouns
P. fluorescens WCS 358 Arabidopsis
LPS, siderofor, flagela Kacang polong
LPS, siderofor Tomat
LPS, siderofor P. fluorescens GRP3
Padi Siderofor
Rhizobium etli G12 Kentang
LPS S. marcescens 90-166
Tembakau Fe regulated compouns
Siderofor merupakan senyawa pengkelat besi yang diproduksi oleh berbagai bakteri dan fungi pada lingkungan yang kekurangan besi. Beberapa bakteri PGP
mampu menghasilkan variasi siderofor yang memiliki afinitas tinggi dibandingkan dengan bakteri dan fungi lainnya sehingga kemampuan
kompetisinya dalam mendapatkan dan menyerap unsur besi lebih kuat dibandingkan mikroba lainnya Compant et al. 2005. Selain siderofor, beberapa
jenis antibiotik telah ketahui terlibat dalam mekanisme pengendalian patogen oleh
bakteri PGP. Antibiotik tersebut diantaranya adalah amphisin, 2,4- diacetylphloroglucinol DAPG, higrogen sianida, oomycin A, phenazine,
pyoluterin, pyrronitrin, tensin, tropolone, ecomycin lipopeptida siklik, oligomycin A, kanosamin, zwittermicin A, dan xanthobaccin. Beberapa antibiotik
yang dihasilkan oleh bakteri PGP tersebut juga telah digunakan pada berbagai percobaan farmasi Compant et al. 2005; Ryan et al. 2008.
Beberapa jenis bakteri PGP juga menunjukkan aktivitas hiperparasit terhadap fungi fitopatogenik dengan cara memproduksi enzim-enzim pelisis
dinding sel fungi, misalnya kitinase. Kitinase yang dihasilkan oleh Serratia plymuthica dapat menghambat pemanjangan tabung kecambah B. cinerea.
Produksi kitinase oleh S marcescens menyebabkan bakteri ini bersifat antagonis terhadap S. rolfsii, sedangkan pada Paenibacillus sp. strain 300 dan Streptomyces
sp. strain 385
kitinase bersama β-1-3 glukanase menimbulkan sifat antagonis terhadap F. oxysporum f. sp. cucumerinum. Pada S plymutica IC14, enzim
protease terlibat dalam aktivitas antagonisme terhadap S. rolfsii dan B. cinerea. Degradasi senyawa autoinduser AHL oleh enzim laktonase dan asiklase yang
dihasilkan oleh bakteri PGP juga mampu memblok ekspresi faktor-faktor virulensi bakteri fitopatogen sehingga menurunkan atau menghilangkan
patogenisitasnya Compant et al. 2005.
Pengendalian fitopatogen oleh bakteri PGP juga dapat terjadi melalui mekanisme detoksifikasi atau degradasi faktor-faktor virulensi. Bakteri Klebsiella
oxytoca dan Alcaliges denitrificans memproduksi protein yang dapat mengikat toksin albicidin yang dihasilkan oleh X. albilineans. Albicidin juga dapat
didegradasi oleh enzim esterase yang dihasilkan oleh Pantoea dispersa Compant et al. 2005.
Ekspresi faktor-faktor virulensi bakteri patogen dapat dihambat melalui mekanisme quorum quenching penghambatan proses Quorum Sensing. Chernin
et al. 2011 melaporkan bahwa produksi senyawa-senyawa organik volatile oleh P fluorescens B-4117 dan S plymuthica IC1270 mampu menghambat produksi
senyawa signal autoinduser QS AHL pada Agrobacterium, Chromobacterium, Pectobacterium, dan Pseudomonas. Beberapa enzim mikroba telah diketahui
berperan dalam proses quorum quenching bakteri fitopatogen melalui inaktivasi senyawa signal autoinduser QS. B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis Dong
et al. 2000; Dong et al. 2001, P. aeruginosa PAI-A, Arthrobacter sp., K. pnemoniae, A. tumefaciens, dan Rhodococcus sp. Uroz et al. 2003, Carlier et al.
2003; Park et al. 2003; Huang et al. 2003 menghasilkan enzim yang dapat membuka cincin lakton pada molekul AHL. E
nzim β-hidroksipalmitat metil ester hidrolase juga dilaporkan dapat menghambat ekspresi faktor-faktor virulensi pada
R. solanacearum. Enzim ini menghidrolisis senyawa signal QS 3 hidroksipalmitat metil ester yang dihasilkan oleh R. solanacearum Shinohara et
al. 2007.
VOCs Sebagai Penginduksi Ketahanan Tanaman
Secara umum, kemampuan mikroba dalam memproduksi senyawa organik yang mudah menguap VOCs sudah lama diketahui. Aroma segar dari kultur
murni mikroba seperti khamir dan bakteri asam sitrat atau laktat, serta aroma menyengat pada berbagai produk fermentasi adalah bukti sederhana keberadaan
senyawa-senyawa dari kelompok asam organik sitrat, asam asetat, asam laktat,
propionat, dsb., alkohol, ester, merkaptan, pentilfuran dan sebagainya yang merupakan produk metabolisme mikroba. Namun bukti ilmiah tentang aktivitas
VOCs sebagai penginduksi pertumbuhan dan resistensi tanaman baru mulai dipublikasikan pada tahun 2003 Ryu et al. 2003a; Ryu et al. 2004. Sejak itu,
peran kelompok senyawa VOCs dalam induksi ketahanan tumbuhan mulai mendapat banyak perhatian dan menarik minat peneliti-peneliti lainnya untuk
mengeksporasi dan mengkaji potensi pengembangan serta aplikasinya.
Percobaan menggunakan tanaman A. thaliana mutan dan transgenik membuktikan bahwa ketahanan tanaman tersebut dapat diinduksi oleh senyawa
volatil acetoin dan 2,3-butenadiol yang diemisikan oleh Bacillus GB-03. Induksi sistem ketahanan A. thaliana tersebut terjadi melalui aktivasi lintasan Induce
Systemic Resistance ISR dan berhubungan dengan lintasan etilen Ryu et al. 2004. Bukti peran kedua senyawa tersebut dalam meningkatkan ketahanan
tanaman diperkuat oleh hasil penelitian berikutnya yang dilakukan dengan menggunakan galur Bacillus GB-03 mutan BSIP1173 dan BSIP1174 yang tidak
mampu mensintesis kedua senyawa volatil tersebut. Berbeda dengan A. thaliana yang diinokulasi dengan Bacillus GB-03, tanaman A. thaliana yang diinokulasi
dengan kedua BSIP1173 atau BSIP1174 tidak mampu meningkatkan kapasitas ISR-nya setelah diinfeksi dengan bakteri patogen Erwinia carotovora Ryu et al.
2005.
Selain kemampuannya dalam menginduksi ketahanan tanaman, VOCs yang diemisikan oleh bakteri seperti seperti benzothiazole, cyclohexanol, n-decanal,
dimetil trisulfit, 2-etil-1-hexanol dan nonanal juga memiliki aktivitas antimikroba. Sifat antimikroba dari senyawa-senyawa tersebut dapat dimanfaatkan untuk
mengendalikan fitopatogen Fernando et al. 2005. Menurut Song dan Ryu 2013, selain dapat menginduksi ketahanan tumbuhan, VOCs merupakan kandidat
yang potensial dan menjanjikan untuk dimanfaatkan sebagai agen pengendalian dalam pengelolaan hama dan penyakit karena efektivitasnya tinggi, tidak mahal,
dan hanya memerlukan konsentrasi yang relatif rendah dibandingkan senyawa agrokimia lainnya.
Percobaan lapangan yang dilakukan menggunakan senyawa organik volatil 3-pentanol dan 2-butanon pada konsentrasi 0.1 mM dan 0.1 nM berturut-turut
untuk kedua senyawa tersebut menunjukkan kedua senyawa tersebut secara nyata mampu menginduksi ketahanan tanaman mentimun terhadap Pseudomonas
syringae pv. lachrymans. Penurunan nilai Disease severity yang dihasilkan oleh aplikasi kedua senyawa volatil tersebut sama dengan penurunan nilai Disease
severity yang disebabkan oleh aplikasi 1 mM senyawa agrokimia benzotiadizol Actigard
®
, Syngenta. Selain itu menginduksi ketahanan terhadap P. syringae pv. lachrymans kedua senyawa tersebut juga terbukti mampu melindungi tanaman
mentimun terhadap serangan hama aphid pengisap Myzus persicae Song dan Ryu 2013.
Aplikasi Bakteri Endofit untuk Meningkatkan Resistensi, Pertumbuhan dan Produktivitas Tanaman
Bakteri endofit yang memiliki karakter unggul dapat diisolasi dari alam dan berpotensi digunakan sebagai inokulan untuk diaplikasikan pada bibit tanaman
sebagai salah satu cara untuk melindunginya dari infeksi fitopatogen Jie et al.
2010 serta meningkatkan resistensi dan pertumbuhannya Choudhary dan Johri 2009; Ryan et al. 2008; Hoon et al. 2007; Tsavkelova et al. 2006; Compant et al.
2005 Kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan fitohormon dan meningkatkan ketersediaan nutrisi bagi inang secara langsung dapat
meningkatkan pertumbuhan tanaman inang. Kemampuannya untuk beradaptasi dan berkembang di dalam jaringan tumbuhan inang tanpa menimbulkan efek
negatif merupakan kelebihan bakteri endofit. Oleh karena itu, aplikasi bakteri endofit secara dini dapat melindungi tanaman inangnya dari infeksi dan kolonisasi
patogen. Secara tidak langsung, kondisi tanaman yang sehat dan terlindung dari fitopatogen akan meningkatkan pertumbuhan dan produktivitasnya.
Percobaan menujukkan bahwa plantlet kentang yang ditumbuhkan bersama- sama dengan bakteri endofit mengalami peningkatan pertumbuhan yang dramatis
dibandingkan dengan plantlet yang ditumbuhkan tanpa bakteri endofit. Peningkatan pertumbuhan tersebut diturunkan pada plantlet hasil perbanyakan
pada generasi berikutnya Frommel, 1991. Efek peningkatan pertumbuhan juga teramati pada planlet anggur yang diinokulasi dengan bakteri endofit Compant et
al. 2005.
Hasil penelitian Krechel et al.2002 dan Sessitsch et al. 2004 menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman kentang
memiliki aktivitas antagonis terhadap berbagai patogen asal tanah diantaranya Erwinia carotovora, Phytophtora cactorum, R. solani, V. dahlia, Sclerotium
sclerotium, and M. incognita. Percobaan inokulasi Pseudomonas fluorescens B1 dan Serratia plymuthica B4 secara bersama-sama pada plantlet kentang terbukti
dapat menurunkan hilangnya berat kering dan nilai keparahan penyakit Disease Severity yang disebabkan oleh R. solani. Efektivitas tertinggi bakteri endofit
dalam menekan penyakit kentang dilapangan dilaporkan oleh Faitlin dkk. Inokulasi P. florescens B1 dapat menekan timbulnya penyakit yang disebabkan
oleh R. solani Kuhn di lapangan sampai 37 dan meningkatkan produksi umbi kentang sampai 12. Sedangkan inokulasi Serratia plymuthica B4 meningkatkan
produksi umbi kentang sampai 17 Faitlin et al. 2004.
Inokulasi bakteri endofit juga terbukti berhasil menginduksi ketahanan sistemik plantlet pisang terhadap virus buncy top Kavino et al. 2007. Bahkan
plantlet pisang yang telah diinokulasi bakteri endofit dan ditanam di rumah kaca selama 5 bulan menunjukkan peningkatan ketahanan hingga 67 terhadap
penyakit layu yang disebabkan oleh F.oxysporum f. sp. cubense ras 4. Selain peningkatan resistensi terhadap penyakit, pertumbuhan planlet pisang yang
dinokulasi endofit juga terlihat lebih baik. Hasil-hasil penelitian tersebut membuktikan bahwa inokulasi bakteri endofit dapat dimanfaatkan sebagai dasar
pengkayaan ekologis untuk mengendalikan penyakit dan pertumbuhan tanaman.
BAHAN DAN METODE Prosedur Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit
Contoh tanaman
Tanaman kentang diambil bersama-sama dengan tanah bagian rizosfernya dari lokasi 1 kebun Gapoktan Multi Tani Jaya Giri Desa Cipendawa, Cipanas,
Cianjur 2 kebun percobaan Balai Penelitian Tanaman Sayuran Lembang, 3 screen house di Cisurupan Garut, dan 4 lahan pertanaman kentang di Desa
Mulyasari Pasirwangi Garut Lampiran 1. Wilayah-wilayah tersebut dipilih sebagai tempat pengambilan sampel tanaman kentang karena merupakan daerah
penghasil kentang di wilayah Jawa Barat. Jarak antara lokasi pengambilan sampel dan laboratorium tempat isolasi yang dapat ditempuh kurang dari 24 jam juga
menjadi salah satu pertimbangan pemilihan lokasi-lokasi tersebut, sehingga kondisi sampel yang diambil tetap segar ketika diisolasi bakterinya. Diantara
ketiga daerah tersebut, luas area pertanaman dan produksi kentang di dataran tinggi Garut adalah paling tinggi, sehingga wilayah ini menjadi salah satu pusat
penghasil bibit kentang dan umbi kentang di Indonesia.
Tanaman kentang yang diambil berumur 6 sampai 8 minggu, dan dipilih tanaman sehat yang tumbuh di dekat tanaman yang menunjukkan gejala layu
bakteri. Tanaman bersama tanah tempat tumbuhnya dimasukkan ke dalam amplop coklat besar dalam posisi berdiri, selanjutnya bagian bawah amplop dimasukkan
ke dalam kantong plastik. Sampel tanaman diatur dan diletakkan dalam posisi berdiri dalam bak plastik. Kesegaran tanaman dijaga dengan cara memercikkan air
mineral kemasan ke bagian tajuk dan tanahnya selama proses transportasi dari lapangan sampai ke laboratorium di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian BB BIOGEN Bogor untuk diisolasi bakteri endofitnya. Sampel tanaman yang sampai di Laboratorium pada
malam hari selanjutnya segera diisolasi pada hari berikutnya. Selisih waktu pengambilan sampel di lapangan dengan waktu pelaksanaan isolasi bakteri endofit
tidak lebih dari 24 jam.
Optimasi sterilisasi permukaan akar
Sebanyak 24 contoh tanaman kentang Granola umur 5-7 minggu asal Cipanas, Lembang, dan Garut dipergunakan sebagai bahan untuk optimasi
sterilisasi permukaan akar. Tanaman 8 contoh tanaman dari Garut, dan masing- masing 8 tanaman dari Cipanas dan Lembang dibersihkan dari tanah yang
menempel di daerah akar lalu dicuci dibawah air mengalir. Bagian akar dipotong dan dipisahkan dari bagian tanaman lainnya. Masing-masing sampel akar dibagi
menjadi 4 bagian yang relatif sama.
Sterilisasi sampel bagian pertama dilakukan dengan urutan sebagai berikut : direndam selama 1 menit dalam 1.5 larutan bleaching komersial
BAYCLIN, Johnson Home Hygiene Product, Indonesia;
mengandung 5.25 NaOCl dibilas dengan akuades steril, direndam selama 5 menit dalam ethanol 75, dan terakhir
dibilas 2 kali dengan akuades steril. Sampel kedua disterilisasi dengan urutan berikut: direndam selama 1 menit dalam 2.5 larutan bleaching komersial, dibilas
dengan akuades steril, direndam selama 5 menit dalam ethanol 75, dan terakhir dibilas 2 kali dengan akuades steril Gambar 4.
Sampel bagian ketiga dan keempat masing masing dimasukkan secara terpisah ke dalam mangkuk ultrasonic cleaner ULTRA 7000, James Product Ltd.
Sturminster Newton, Dorset, UK berisi akuades steril dingin dan dilanjutkan dengan sonikasi bertahap 5 kali. Setiap tahap sonikasi dilakukan selama 2 menit
dalam akuades steril dingin yang baru. Selanjutnya untuk sampel bagian ketiga dilanjutkan dengan tahapan sterilisasi seperti yang dilakukan terhadap sampel
bagian pertama. Sedangkan sterilisasi sampel keempat dilanjutkan dengan tahapan sterilisasi seperti yang dilakukan terhadap sampel kedua Gambar 4. Masing-
masing bagian sampel ditiriskan diatas kertas tissue steril yang terletak di dalam cawan petri besar steril.
Keberhasilan sterilisasi permukaan dicek dengan cara menginokulasikan 100 µL air bilasan terakhir dari masing-masing prosedur
sterilisasi ke permukaan media Trypticase Soy Agar TSA : TSB 30 gL, agar-agar BIOTEK 20 gL. Selain itu, pengecekan juga dilakukan dengan cara
mengusapkan permukaan akar yang telah disterilisasi permukaannya ke media TSA. Inokulasi air bilasan dan pengusapan akar ke media TSA masing-masing
dilakukan dalam tiga ulangan.
Cawan-cawan TSA tersebut tersebut di-seal menggunakan plastict wrap selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang 29ºC-30ºC selama 3 hari. Pengamatan
dilakukan terhadap terhadap jumlah koloni yang tumbuh dari masing-masing prosedur sterilisasi permukaan akar yang telah dilakukan. Prosedur sterilisasi
yang tidak menghasilkan pertumbuhan koloni mikroba dari air bilasan terakhirnya mikroba phyloplant atau rhizosphere pada media TSA kontrol dipilih sebagai
prosedur sterilisasi sampel akar yang akan diisolasi bakteri endofitnya.
Sterilisasi permukaan batang dan daun
Tanaman dibersihkan dari tanah yang menempel, dicuci dibawah air mengalir, lalu ditiriskan diatas kertas tissue. Bagian batang dipisahkan dari bagian akar dan
daunnya menggunakan gunting steril kemudian dipotong-potong dengan ukuran ± 4 cm sebelum disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan cara direndam selama 1
menit dalam 2.5 larutan bleaching komersial
BAYCLIN, Johnson Home Hygiene Product, Indonesia
yang mengandung 5.25 NaOCl, dibilas dengan akuades steril, direndam selama 5 menit dalam ethanol 75, dan terakhir dibilas 2
kali dengan akuades steril. Daun-daun beserta tangkainya disterilisasi dengan cara yang sama dengan cara sterilisasi bagian batang.
Konfirmasi keberhasilan proses sterilisasi dilakukan dengan cara menempelkan sesaat permukaan sampel batang atau daun masing-masing 3 buah
ke media TSA, serta menginokulasikan air bilasan terakhir ke media TSA seperti diuraikan diatas. Jika dalam waktu 24 atau 48 jam setelah inkubasi, terdapat
koloni mikroba yang tumbuh pada media TSA tersebut, maka proses sterilisasi dianggap gagal dan proses isolasi yang dilakukan dengan sampel tersebut harus
diulang mulai dari awal.
Isolasi bakteri endofit dari jaringan tanaman kentang
Akar, batang, dan daun yang telah disterilisasi masing-masing dipotong kecil-kecil lalu digerus dengan mortar secara terpisah. Hasil gerusan masing-
masing diencerkan secara serial dengan akuades steril kemudian disebarkan pada media TSA 20 TSB 6 gL, agar-agar 20 gL, King’s B Agar KBA 20
proteosa pepton 4 gL, K
2
HPO
4
. 3H
2
O 0.3 gL, MgSO
4
.7H
2
O 0.3 gL, gliserol 4 mlL dan Agar-agar 20 gL, dan agar Nitrate Mineral Salt NMS bebas N
MgSO
4
.7H
2
O 1.0 gL, CaCl
2
.6H
2
O 0.2 gL, KH
2
PO
4
0.272 gL, Na
2
HPO
4
4.0 gL, Na
2
EDTA 0.5 gL, FeSO
4
.7H2O 0.2 gL, H
3
BO
4
0.03 gL, CoCl
2
.6H
2
O 0.02 gL, ZnSO
4
.7H
2
O 0.01 gL, MnCl
2
.4H
2
O 3.0 mgL, Na
2
MoO
4
.2H
2
O 3.0 mgL, NiCl
2
.6H
2
O 2.0 mgL dan CaCl
2
.2H
2
O 1.0 mgL, methanol 100 mLL , dan Bacto Agar 15 gL. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang dan kondisi gelap selama 2 hari
sampai 6 minggu. Koloni yang tumbuh pada media isolasi dan menunjukkan morfologi koloni yang berbeda dipilih dan dimurnikan dengan teknik penggoresan
kuadran pada media yang sama. Tahapan proses isolasi bakteri endofit secara garis besar ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Diagram alir isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang
Penapisan Isolat Bakteri Endofit Kentang Tahap I
Isolat-isolat yang diperoleh ditapis secara bertahap. Tahapan penapisan terdiri dari penapisan awal yang meliputi bioessei Hypersentive Response HR,
uji hemolitik, uji patogenisitas terhadap planlet kentang, dan uji kemampuan menurunkan Disease Insidence DI pada kondisi penanaman tidak steril Gambar
6.
Gambar 6 Diagram alir penapisan isolat bakteri endofit dan kajian perubahan fisiologis inang
Bioesei Hypersentive Response HR
Isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada media TSA seama 2-7 hari, E. coli ditumbuhkan pada media Luria Berthani Agar LBA : yeast extract 5 gL, trypton
10 gL, NaCl 10 gL, dan agar-agar BIOTEK 20 gL selama 2 hari, dan Ralstonia solanacearum ditumbuhkan pada media Sucrose Peptone Agar SPA : sukrosa 20
gL, Pepton 5 gL, MgSO
4
7H
2
O 0.5 gL, KH
2
PO
4
0.25 gL, dan agar-agar BIOTEK 20 gL selama 7 hari. Koloni bakteri yang tumbuh diambil dengan lup
inokulasi kemudian disuspensikan dengan garam fisiologis steril sampai diperoleh kepadatan sel ± 10
7
selmL. Sebanyak 0.5-1.0 mL masing-masing suspensi bakteri diinfiltrasikan ke permukaan bawah daun tembakau Nicotiana tabaccum
umur 2 bulan. Pengamatan terhadap reaksi HR yang timbul di bagian yang diinfeksi dilakukan setiap hari selama 7 hari berturut-turut. Bioesei HR untuk
masing-masing isolat dilakukan dalam 5 ulangan.
Uji hemolitik
Uji aktivitas hemolitik dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri ke permukaan media agar darah yang komposisinya terdiri dari : Blood
Agar Base BBL 40 gL, dan darah domba steril yang telah di-defibrinasi sebanyak 50 mlL Snavely dan Brahier 1960. Setelah diinkubasi selama 1-5 hari
pada suhu ruang 29°C-30°C, dilakukan pengamatan ada tidaknya aktivitas hemolitik di sekitar koloni bakteri. Isolat-isolat yang tidak menunjukkan aktivitas
hemolitik merupakan isolat terpilih yang digunakan sebagai bahan pada percobaan berikutnya. E. coli K1.1 koleksi IPB Culture Collection IPBCC digunakan
sebagai kontrol posif pada uji ini. Uji hemolitik untuk setiap isolat dilakukan dalam 3 ulangan.
Uji patogenisitas isolat terhadap planlet kentang
Inokulum bakteri endofit terpilih ditumbuhkan pada medium TSA selama 5- 7 hari. Koloni yang telah tumbuh diambil degan ose selanjutnya disuspensikan
dalam akuades steril. Sebanyak 100 µL suspensi bakteri ± 1.0 x10
7
sel mL diteteskan ke media disekitar akar planlet kentang Granola berumur 2 minggu.
Sebagai kontrol, akuades steril digunakan untuk menggantikan suspensi bakteri endofit yang diinokulasikan. Planlet yang telah diinokulasi diinkubasi kembali
dan gejala penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri yang diinokulasikan diamati selama 10 hari. Penumbuhan planlet dilakukan pada kondisi berikut : media
Murashige-Skoog, suhu 23ºC, 8 jam gelap dan 16 jam terang intensitas cahaya 2500 lux. Planlet yang sehat diinkubasi lebih lanjut sampai berumur 4 minggu
untuk digunakan sebagai bahan percobaan berikutnya. Uji ini dilakukan masing- masing dalam 3 ulangan satu planlet dalam satu botol kultur setiap ulangan
untuk setiap isolat.
Uji ketahanan tanaman Generasi 0 G0 yang diperkaya isolat bakteri endofit terhadap layu bakteri
Plantlet-plantlet yang telah diinokulasi dengan bakteri endofit dan tidak menunjukkan gejala penyakit sehat dan telah berumur 4 minggu ditanam dalam
polybag berisi 3 kg media tanam tidak steril yang terdiri atas campuran kompos kotoran ayam, tanah, dan sekam bakar dengan perbandingan 1:1:1. Polybag yang
telah ditanami bibit kentang tersebut dipelihara dalam sungkup plastik di Kebun Percobaan BB-BIOGEN Pacet Cianjur, Jawa Barat. Penyiraman dilakukan
menggunakan air embung yang terdapat di kebun tersebut. Jumlah planlet yang ditanam masing-masing sebanyak 5 plantlet untuk setiap perlakuan. Pada
percobaan ini tidak ada pupuk kimia atau pestisida yang diaplikasikan.
R. solanacearum Rs ditumbuhkan pada media SPA selama 5-7 hari pada suhu ruang. Koloni R. solanacearum yang tumbuh diambil menggunakan lup
kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Suspensi patogen tersebut ±1x10
8
selmL digunakan untuk menginokulasi tanaman kentang generasi 0 G0 yang telah berumur 1.5 bulan. Inokulasi dilakukan dengan cara mengorek tanah
berjarak ±3 cm dari pangkal batang sehingga ada 1-2 akar rambut yang terpotong. Selanjutnya sebanyak 5 mL suspensi R. solanacearum disiramkan ke sekitar
bagian akar yang terpotong dan rizosfer di sekitarnya. Gejala layu bakteri yang muncul diamati sampai masa panen 12 minggu. Perlakuan endofit yang berhasil
melindungi semua tanaman dalam setiap perlakuan 5 tanaman dari penyakit layu bakteri diamati parameter pertumbuhannya biomasa tajuk, biomasa akar, jumlah
dan berat umbi.
Pengukuran densitas sel bakteri
Densitas sel bakteri dalam suspensi inokulum ditentukan dengan menggunakan kombinasi teknik spektrofotometri dan plate count Hadioetomo,
1993. Bakteri yang akan diukur densitasnya ditumbuhkan pada media yang sesuai TSA untuk bakteri endofit, SPA untuk R. solanacearum. Biomasa sel
yang diperoleh dari kultur padat disuspensikan dalam akuades steril atau larutan garam fisiologis kemudian diencerkan secara serial 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, dst..
Sebagian suspensi sel dari masing-masing tingkat pengenceran diukur nilai Optical Density-nya OD pada panjang gelombang 600 nm. Sisa suspensi sel dari
masing-masing tingkat pengenceran diencerkan lebih lanjut secara serial 10
-1
, 10
- 2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, dst. kemudian sebanyak 100 µL hasil pengenceran tersebut disebarkan pada cawan agar yang sesuai. Semua agar cawan yang telah
diinokulasi diinkubasi pada suhu ruang selama 4-7. Pengukuran densitas sel bakteri pada kultur cair dilakukan dengan cara yang sama tetapi pengenceran
dilakukan menggunakan media cair yang sesuai. Jumlah koloni yang tumbuh pada setiap agar cawan dihitung. Nilai jumlah koloni yang tumbuh dari masing-masing
tingkat pengenceran dan nilai OD-nya digunakan untuk mendapatkan persamaan kurva konversi nilai OD menjadi densitas sel permililiter.
Penapisan Isolat Bakteri Endofit Kentang Tahap II Evaluasi ketahanan tanaman G0 yang diperkaya isolat bakteri endofit pada
media steril Seleksi lanjut dilakukan dengan menanam kembali planlet yang sebelumnya
telah diinokulasi dengan 2 isolat bakteri endofit terpilih pada 3 kg media tanam seperti yang dilakukan pada tahap seleksi awal namun media tanam dan air yang
digunakan untuk menyiram tanaman telah disterilkan terlebih dahulu. Selanjutnya setelah tanaman berumur 1.5 bulan diinfeksi dengan R. solanacearum. Percobaan
dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok RAK yang terdiri dari 6 perlakuan yaitu tanaman kontrol yang tidak diperkaya endofit dan tidak diinfeksi
R. solanacearum K, tanaman kontrol yang diinokulasi R. solanacearum K
+Rs
, tanaman diperkaya isolat G053, tanaman diperkaya isolat G062, tanaman
diperkaya isolat G053 dan diinokulasi R. solanacearum G053
+Rs
, dan tanaman diperkaya isolat G062 dan diinokulasi R. solanacearum G062
+Rs
. Setiap perlakuan terdiri dari 3 ulangan dan setiap ulangan terdiri dari 8 tanaman.
Pengamatan dilakukan terhadap Nilai Disease Incidence DI layu bakteri yang dihitung menggunakan persamaan berikut Kelman 1954:
n = jumlah planlet atau tanaman yang sakit
N = jumlah planlet atau tanaman yang diamati
Pengolahan data dilakukan menggunakan program SAS versi 6.12. Nilai DI yang diperoleh dianalisa ragamnya dan apabila ada perbedaan yang nyata dilanjutkan
dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf 0.05.
Evaluasi DI tanaman Generasi 1 G1 pada media tidak steril.
Evaluasi DI tanaman G1 dilakukan terhadap 3 perlakuan tanaman yaitu tanaman G1
Kontrol
, G1
G053
, dan G1
G062
. Masing-masing perlakuan terdiri dari 15 ulangan, dan setiap ulangan terdiri dari 1 tanaman G1. Umbi yang dihasilkan oleh
tanaman G0 kontrol, tanaman diperkaya isolat G053, dan tanaman diperkaya G062 pada percobaan sebelumnya evaluasi ketahanan tanaman G0 pada kondisi
steril disimpan di dalam lemari pendingin. Umbi yang telah disimpan selama ±3 bulan dan telah bertunas ditanam pada media tanam komposisi seperti media
tanam pada uji ketahanan tanaman pada penapisan awal yang tidak steril di screen house di Desa Cipendawa, Cipanas, Cianjur. Tanaman G1 tersebut disiram
dengan air yang langsung diambil dari aliran air gunung di kebun. Tanaman G1 tidak diinokulasi secara artifisial, oleh karena itu nilai DI dihitung berdasarkan
infeksi yang terjadi secara alami.
Analisis respon fisiologis tumbuhan terkait ketahanan a. Penentuan kandungan protein total.
Masing-masing sebanyak 8 polybag tanaman kontrol 1 tanaman per-polybag, tanaman G053, dan tanaman
G062 yang berumur 1.5 bulan dipindahkan dari kebun percobaan BB-BIOGEN di Pacet ke dalam low temperature incubator
23 ⁰C, 14 jam terang dan 10 jam
gelap di Laboratorium Mikrobiologi, Kelti Biokimia BB-BIOGEN. Setelah
tanaman dibiarkan beradaptasi selama 3 hari, dari masing-masing tanaman diambil 200 mg daun muda yang telah berkembang sempurna daun ketiga dari
pucuk. Daun-daun tersebut digerus menggunakan mortar yang telah didinginkan di dalam freezer. Hasil gerusan dihomogenisasi dengan 10 ml buffer fosfat pH 6.8
lalu disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang merupakan ekstrak daun diambil dan dipindahkan ke dalam
botol pyrex bertutup ulir yang telah didinginkan terlebih dahulu. Sebanyak 4 tanaman dari masing-masing perlakuan diinfeksi dengan suspensi R.
solanacearum, sedangkan sisanya diperlakukan dengan cara yang sama tetapi dengan akuades kontrol negatif yang tidak diinfeksi R. solanacearum. Infeksi R.
solanacearum dilakukan dengan cara seperti diuraikan di bagian sebelumnya. Dua puluh empat jam dan 48 jam kemudian dilakukan kembali pengambilan sampel
daun dari semua tanaman yang diinfeksi R. solanacearum dan tanaman yang tidak diinfeksi R. solanacearum untuk diekstraksi seperti diuraikan diatas.
Ekstrak daun yang diperoleh ditentukan kandungan protein totalnya menggunakan teknik microassay sebagaimana yang dipublikasikan oleh Bradford 1976. Satu
mililiter reagen protein ditambahkan ke dalam tabung berisi 100 µL supernatan atau larutan Bovine Serum Albumin BSA yang dipergunakan sebagai standar
protein. Campuran reaksi divortex, dibiarkan selama 2 menit, dan akhirnya diukur absorban-nya pada panjang gelombang 565nm. Pengukuran protein dilakukan
dalam 4 ulangan.