Penetapan kandungan lignin like compound. Biomasa sampel tanaman

Potensi genetik produksi of 2,4-diasetilfloroglusinol DAPG oleh isolat G062 dideteksi menggunakan pasangan primer phl2a 5’-GAGGACGTCGAA- GACCACCA-3’ dan phl2b 5’-ACCGCAGCATCGTG-TATGAG-3’, sedangkan untuk produksi gen pyrrolnitrin dengan menggunakan pasangan primer prnCf 5’-CCACAAGCCCGGCCAGGAGC-3’ dan prnCr 5’-GAGAAG- AGCGGG-TCGATGAAGCC-3’. Kondisi amplifikasi untuk kedua gen metabolit sekunder tersebut sebagaimana kondisi PCR yang dipublikasikan oleh Raaijmakers et al. 1997 dan Mavrodi et al. 2001. Karakterisasi fisiologis dan biokimia a. Uji fisiologis dan biokimia umum . Kultur yang dipergunakan untuk uji fisiologis dan biokimia ditumbuhkan pada media TSA atau TSB dan diinkubasi pada suhu ruang 29 ⁰C-30⁰C selama 24 jam bila tidak ada keterangan lain yang disebutkan secara khusus. Penggolongan tipe Gram sel yang diambil dari kultur umur 24 jam dilakukan menggunakan metode non-staining Buck, 1982 dan selanjutnya diverifikasi menggunakan metode pewarnaan Benson 2001 serta pengamatan pada perbesaran 1000 kali menggunakan mikroskop medan terang Olympus CH20BIMF200. Uji aktivitas katalase dilakukan dengan cara mengamati pembentukan gelembung pada 1 lup massa sel bakteri yang dicampur dengan 1-2 tetes H 2 O 2 3, sedangkan aktivitas oksidase diuji dengan menggunakan oxidase paper Difco. Aktivitas kitinolitik, proteolitik, dan amilolitik berturut-turut diobservasi pada kultur umur 7 hari yang tumbuh pada media 1 wv TSA yang mengandung 1 koloidal kitin, 1 susu skim, dan 1 soluble starch sedangkan aktivitas hidrolisis CMC Carboxy methyl cellulose di amati pada kultur yang tumbuh pada media agar CMC. Aktivitas pelarutan fosfat isolat terpilih diuji pada media agar Pikovskaya Pikovskaya, 1948. Tingkat toleransi terhadap NaCl diamati dengan cara menumbuhkan bakteri pada media kaldu LB yang mengandung NaCl pada berbagai konsentrasi 0-15. Penentuan pH pertumbuhan dilakukan dengan cara menumbuhkan bakteri pada media TSB yang telah diatur pH-nya menggunakan larutan NaOH atau HCl. Sedangkan penentuan suhu pertumbuhan dilakukan terhadap kultur cair bakteri yang diinkubasi pada suhu 13 ⁰C, 18⁰C, 20⁰C, 30⁰C, 37⁰C, 40⁰C, dan 42⁰C. Kultur untuk uji toleransi NaCl serta suhu dan pH pertumbuhan diinkubasi sambil digoyang pada kecepatan 75 rpm diatas shaker. Pertumbuhan kultur-kultur tersebut diamati dengan cara diukur rapat optisnya pada 600 nm. Selain uji-uji yang telah diuraikan diatas, uji fisiologis dan biokimia untuk isolat G062 juga dilakukan menggunakan kit API 20NE bioMerieux SA, Lyon, France.

b. Uji aktivitas fiksasi nitrogen. Aktivitas fiksasi nitrogen isolat terpilih

diuji dengan cara mengamati kemampuan tumbuh isolat yang diuji pada media agar LGI yang telah dimodifikasi K 2 HPO 4 0.2 gL; KH 2 PO 4 0.6 gL; MgSO 4 .7H 2 O 0.2 gL; CaCl 2 0.02 gL; Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0.002 gL; FeCl 3 0.01 gL; arabinosa 3 gL; manitol 3 gL; asam malat 3 gL; dan agar Bacto 15 gL dan uji aktivitas reduksi asetilen Acetylene reduction assay: ARA terhadap kultur yang tumbuh pada media semi padat LGI komposisi seperti agar LGI tetapi hanya mengandung agar Bacto 8 gL. Inokulum untuk uji ARA disiapkan dengan cara menginokulasikan masing- masing 1 lup biakan padat isolat G053 dan G062 umur 72 jam ke dalam 10 mL media cair LGI kemudain diinkubasi pada suhu ruang 29°C-30°C diatas shaker selama 3 hari. Sebanyak 0.1 mL kultur inokulum isolat G053 dan G062 umur 48 jam masing-masing diinokulasikan ke dalam tabung reaksi bertutup ulir ukuran 15 mL yang memiliki sumbat karet dibagian tengah tutupnya yang berisi 7 mL media LGI semi padat. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari sebelum diukur ARA-nya. Pengukuran ARA dilakukan menurut Gothwal et al. 2008 di Laboratorium tanah, BBSDLP, Cimanggu, Bogor . Sebanyak 3 mL udara pada bagian head space kultur diambil menggunakan jarum suntik dan sebagai gantinya ke dalam head space tersebut dimasukkan gas asetilen dengan volume yang sama dengan udara yang disedot. Kultur diinkubasi kembali selama 2 jam pada suhu ruang dan kemudian diukur konsentrasi gas etilen yang terbentuk di bagian head space-nya menggunakan perangkat kromatografi gas Hitachi 263- 70 dengan detector FID dan kolom Porapack M . Uji ARA dilakukan dalam 3 ulangan.

c. Uji kemampuan produksi plant growth hormone like compounds. Satu

lup massa bakteri diambil dari koloni yang tumbuh pada TSA kemudian diinokulasikan ke dalam tabung reaksi berisi 5 mL TSB. Setelah diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang 75 rpm selama 24 jam, sebanyak 1 mL kultur tersebut digunakan sebagai inokulum untuk 50 ml media TSB yang baru, dan selanjutnya diinkubasi dengan kondisi yang sama dengan kultur inokulum selama 7 hari. Kultur disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm, suhu 4 ⁰C, selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh sebagian digunakan untuk pengukuran IAA like compound yang dilakukan dengan metode Salkowsky yang telah dimodifikasi oleh Glickmann dan Dessaux 1995. Sisa supernatan diekstraksi Giberellin GA, zeatin, dan ABA like yang terkandung di dalamnya dengan menggunakan etil asetat. Konsentrasi ZPT like diukur menggunakan teknik spektrofotomeri pada panjang gelombang 254 nm, 269 nm, dan 263 nm berturut-turut untuk Gibberellin GA, zeatin, dan ABA like Ergűn et al. 2002. Sebagai standar pengukuran digunakan larutan IAA Merck, Darmstadt, Germany, Giberellin Merck, Darmstadt, Germany, zeatin Sigma, St. Louis MO USA, dan ABA Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherland. Pengukuran IAA dan ketiga ZPT like lainnya berturut-turut dilakukan dalam 4 dan 3 ulangan.

d. Uji kemampuan produksi siderofor . Kemampuan produksi siderofor

isolat terpilih diuji menggunakan metode double layer-CAS agar. Metode ini merupakan metode yang dikembangkan oleh oleh Hu dan Xu 2011 untuk menguji kemampuan bakteri yang bersifat fastidious dalam memproduksi siderofor serta mengatasi efek toksik beberapa komponen CAS agar seperti hexadecyltrimetyl ammonium bromide HDTMA terhadap mikroba yang diuji. Prinsip pengujian ini adalah kompetisi antara siderofor yang dihasilkan oleh mikroba yang diuji dengan kompleks senyawa pengkelat-indikator dalam mengkelat besi yang terdapat di dalam media uji CAS agar. Biakan padat bakteri endofit yang akan diuji ditumbuhkan pada media TSA selama 4-5 hari. Biakan tersebut digoreskan ke atas permukaan media double layer TSA-CAS agar dengan dua ulangan. Isolat yang mengekskresikan siderofor akan membentuk zona berwarna oranye di sekitar koloni setelah diinkubasi selama 2-4 hari.

e. Analisa Fatty Acid Methyl Ester FAME. Isolat bakteri endofit

ditumbuhkan pada media TSA. Setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang, sebanyak 2 lup kultur tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi gelas bertutup ulir. Selanjutnya sebanyak 1 mL reagen saponifikasi NaOH 45 g, metanol 150 mL, dan 150 mL akuadest ditambahkan ke dalam tabung reaksi berisi biomasa bakteri yang akan dianalisa FAME-nya. Tabung ditutup rapat menggunakan penutup yang terbuat dari teflon, di-vortex dengan kuat selama 5-10 detik, kemudian dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 5 menit, di-vortex kembali selama 5-10 detik, dan terakhir dipanaskan lagi di dalam penangas selama 25 menit. Tabung berisi campuran reaksi didinginkan dalam bak berisi air sebelum ditambahkan 2 ml reagen metilasi 325 mL HCl 6.0 N, 275 mL metil alkohol ke dalamnya dan selanjutnya ditutup kembali dengan rapat. Campuran reaksi tersebut di-vortex kuat selama 5-10 detik, kemudian dipanaskan dalam penangas air bersuhu 80ºC ± 1ºC selama 10 ± 1 menit. Campuran reaksi didinginkan kembali dengan cepat di di dalam bak berisi air sebelum dilakukan ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan cara menambahkan 1.25 mL pelarut hexan : tersier-butil-eter = 1:1 selanjutnya tabung ditutup rapat dan dikocok pelan- pelan dengan cara dibolak-balik selama 10 menit. Setelah terbentuk 2 fase, fase air di bagian bawah disedot dan dibuang menggunakan pipet gelas. Fase organik yang tersisa ditambah dengan 3 mL reagen keempat sample clean up : 10.8 g NaOH dalam 900 mL akuades, tabung ditutup rapat, kemudian tabung dibolak- balik selama 5 menit. Tahap selanjutnya, campuran dibiarkan sampai terjadi pemisahan fase. Sebanyak 23 fase organik yang terbentuk diambil dan dimasukkan ke dalam botol sampel GC untuk dianalisa Sasser, 1990. Analisa dilakukan menggunakan perangkat MIDI Sherlock System Agilent, USA dan standar campuran FAME yang direkomendasikan oleh produsen perangkat analisa tersebut. Analisa FAME dilakukan di Laboratorium Center of Ecellence Indigenous Biological Resources-Genome Studies CoE IBR-GS, FMIPA Universitas Indonesia, Depok.

f. Bioesei produksi VOCs dan aktivitas penghambatannya terhadap kultur

R. solanacearum. Kemampuan produksi VOCs isolat bakteri endofit

G053 diuji menggunakan teknik cawan terbagi divided petri plate sebagaimana dipublikasikan oleh Fernando et al. 2005. TSA atau Kings B Agar KBA masing-masing dituang ke dalam ruang pertama yang terdapat pada two compartment petri plate, sedangkan SPA atau SPA yang mengandung 50 mgmL tetrazolium klorida TZC dituang ke dalam ruang kedua. Setelah media memadat, pada permukaan media TSA tersebut digoreskan isolat bakteri endofit kemudian diinkubasi pada suhu ruang dalam keadaan gelap. Sepuluh hari setelah diinkubasi dan bakteri endofit telah tumbuh subur di permukan media, pada permukaan media SPA atau SPA+TZC digoreskan R. solanacearum selanjutnya cawan ditutup kembali, di-seal menggunakan plastic wrap, dan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang dan gelap selama 7 hari. Sebagai kontrol, isolat bakteri endofit dan patogen ditumbuhkan dengan cara yang sama tetapi pada three compartment petri disk. Ruang ketiga diiisi dengan serbuk arang aktif steril pada waktu yang bersamaan dengan inokulasi R. solanacearum. Arang aktif tersebut berfungsi sebagai penjerap VOCs yang dihasilkan oleh isolat yang diuji G053. Cawan kontrol diinkubasi dengan cara yang sama dengan cawan perlakuan Pengamatan motilitas dan morfologi Pengamatan motilitas dan morfologi koloni dan sel isolat G053 dan G062 dilakukan terhadap biakan yang tumbuh pada media TSA atau TSB. Motilitas sel diamati menggunakan teknik preparat tetes gantung dibawah mikroskop medan terang Olympus CH20BIMF200. Morfologi koloni yang diamati meliputi bentuk, warna, elevasi, serta konsistensi. Pengamatan morfologi dan ukuran sel dilakukan terhadap sel yang berasal dari kultur cair berumur 24 jam. Media TSB yang baru diinokulasi dikirim ke Bagian Zoologi, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Cibinong untuk diamati menggunakan mikroskop elektron payar JEOL, JSM-5310 LV pada keesokan harinya. Preparasi sampel dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : sampel difiksasi dalam bufer cacodilat dan glutaraldehid, didehidrasi secara bertahap menggunakan alkohol, kemudian dikering bekukan freeze dried. Specimen yang telah kering tersebut ditempelkan pada permukaan stub, selanjutnya dilapis dengan emas 400 A ◦ Goldstein 1λλ2 dengan menggunakan perangkat Eico I-B2 ion coater. Identifikasi Komponen VOCs dan Pengaruhnya terhadap

R. solanacearum dan Planlet Kentang Trapping dan identifikasi komponen VOCs G053

Satu lup isolat G053 diinokulasikan ke 5 ml TSB, diinkubasi di inkubator bergoyang pada 100 rpm pada suhu ruang. Setelah 24 jam, kultur tersebut diinokulasikan ke dalam 500 mL TSB steril dalam erlenmeyer 2 L. Erlenmeyer ditutup dengan sumbat karet steril yang telah dipasangi dua pipa gelas berbentuk huruf L. Ujung luar pipa pertama disambungkan ke mesin aerator melalui filter millipore PTFE 0.22 µL, glass wool, dan karbon aktif dengan menggunakan selang silicon. Ujung luar pipa kedua dihubungkan menggunakan selang silikon ke filter millipore PTFE 0.22 µL dan pangkal pipet kaca yang ujungnya dimasukkan ke dalam heksan selama proses trapping VOCs Lampiran 5. Pada sepuluh hari pertama inkubasi, mesin aerator dimatikan, tetapi 5 hari terakhir aerator dinyalakan untuk mendorong VOCs ke dalam heksan. Komposisi VOCs yang terkandung dalam heksan dianalisa menggunakan perangkat GC MS Agilent Technologies 7890A Gas Chromatograph with auto sampler and 5975C Mass Selective Detector. GC MS dioperasikan dengan kondisi: impact ionization mode, 70 eV, suhu injeksi 260ºC, suhu sumber ion 230 ºC, suhu interface 280 ºC, suhu quadrupole 140 ºC, dan aliran kolom 0.9 mLmenit -1 . Kolom kapilernya yang digunakan pada analisa ini adalah HP Innowax 30m x 0.25mm x 0.25 µm film thickness. Suhu oven yang digunakan adalah: 80ºC pada 5 menit pertama. Suhu oven selanjutnya ditingkatkan 5ºCmenit sampai tercapai suhu 200ºC selama 5 menit. Akhirnya suhu dinaikkan 10ºC menit sampai mencapai 220ºC dan dipertahankan selama 6 menit. Uji pengaruh VOCs terhadap produksi EPS oleh R. solanacearum Kandungan EPS pada kultur Rs yang tidak terpapar dan terpapar VOCs atau komponen utama VOCs dibandingkan dengan prosedur sebagai diuraikan berikut ini. Lima mikroliter suspensi R. solanacearum diinokulasikan ke permukaan SPA pada ruang II pada two compartment petri disk. Sebagai pembanding, ruang I diisi kertas serap steril yang telah ditetesi 1 mL metil eugenol murni bersamaan dengan waktu inokulasi Ralstonia solanacearum Rs atau diiisi dengan media TSA dan digores dengan isolat endofit 10 hari lebih awal dari inokulasi R.solanacearum. Cawan ditutup kembali dengan rapat dan di-seal menggunakan plastic wrap untuk mencegah keluarnya senyawa volatil. Cawan cawan tersebut diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang dan kondisi gelap dan kemudian dipanen biomasa sel R. solanacearum-nya. Sebanyak 2 mL akuades ditambahkan ke dalam tabung berisi biomasa sel R. solanacearum kemudian divorteks berulang-ulang dengan kuat sampai membentuk suspensi dan tidak terlihat lagi gumpalan biomasa R.solanacearum. Suspensi disentrifuse pada 10000 rpm selama 10 menit. Pellet sel dikeringkan pada suhu 50ºC sampai diperoleh berat yang konstan ±2 hari. Supernatan yang mengandung EPS dipindahkan ke dalam wadah yang baru selanjutnya ditambah dengan etanol sebanyak 3 kali volume. Campuran tersebut disimpan pada freezer selama semalam, kemudian disentrifuse pada 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pellet EPS yang terbentuk dilarutkan kembali dalam akuades sebelum diukur kadar EPS-nya menggunakan metode fenol-asam sulfat sebagaimana yang dipublikasikan oleh Dubois et al. 1956. Uji pengaruh VOCs terhadap munculnya gejala layu bakteri pada planlet Isolat bakteri G053 ditumbuhkan dalam tabung reaksi kecil berisi agar TSA miring. Inokulasi TSA miring tersebut dilakukan secara aseptis pada posisi tabung terletak dalam suatu botol kultur kultur jaringan steril sehingga dinding luar tabung reaksi tidak tersentuh oleh tangan dan terjaga sterilitasnya. Tabung reaksi berisi kultur miring isolat G053 tersebut diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang dan gelap dalam tabung kultur jaringan yang tertutup sebelum dipindahkan ke dalam botol kultur jaringan yang berisi 3 planlet umur 2 minggu. Planlet diinkubasi kembali selama 4 hari, kemudian sebanyak 100 µL suspensi R. solanacerum ± 10 7 selmL di dalam akuades steril atau akuades steril sebagai perlakuan kontrol diteteskan ke media MS di sekitar akar plantlet. Planlet diinkubasi lagi sambil diamati timbulnya gejala layu selama selama 2 minggu setelah inokulasi patogen. Penyimpanan Isolat Isolat murni yang diperoleh diremajakan dan diperbanyak pada media TSA. Kultur padat isolat bakteri endofit yang tidak patogenik terhadap planlet kentang 119 isolat yang telah diremajakan umur 48-72 jam diambil menggunakan lup inokulasi kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah berisi 750 µL gliserol 40 steril. Tabung eppendorf tersebut ditutup rapat, diberi label dan selanjutnya divortex dengan kuat supaya terbentuk suspensi sel yang merata sebelum disimpan pada suhu -20 ⁰C. Penyimpanan jangka panjang juga dilakukan terhadap 4 isolat yang terpilih pada tahap seleksi awal G053, G062, G0196, dan L-12. Keempat isolat terpilih tersebut juga disimpan untuk jangka panjang dengan teknik liofilisasi freeze drying.