UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Adapun kelemahan dalam metode Kjehdal bahwa purin, pirimidin, vitamin- vitamin, asam amino besar, kreatin serta kreatinin ikut teranalis dan terukur
sebagai nitrogen protein Bintang, 2010.
4.4 Analisis Profil Protein Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan SDS- PAGE
Analisis profil protein ekstrak ampas biji jinten hitam ini dilakukan dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai
medium pemisahan. Pada sistem ini, gel yang digunakan terdiri dari dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel gel pemisah dan stacking gel gel
penumpuk. Pemisahan protein dengan elektroforesis gel poliakrilamid berdasarkan pada perbedaan muatan dan ukuran molekul dapat dilakukan
dengan menambahkan detergen ionik dan menambahkan tahap denaturasi Kurniati dan Wanadi, 2001. Pada proses persiapan sampel, sampel
ditambahkan dengan suatu detergen anionik seperti sodium dodesil sulfat SDS. Sebelum elektroforesis, sampel yang akan dipisahkan dilarutkan
terlebih dahulu dalam suatu dapar yang mengandung Tris-HCl, SDS, gliserol, bromfenol biru dan merkaptoetanol.
Tujuan penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari ptotein, terutama ikatan
disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang terikat dengan muatan negatif yang sama
membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS-protein memiliki densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan
ukuran protein Wijaya dan Rohman 2005; Fatmawati et al., 2009. Oleh karena itu, kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas
yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks SDS-protein yang lebih
kecil Fatmawati et al., 2009.
Adapun dalam penelitian, elektroforesis diatur dengan tegangan 200 v konstan dengan arus sebesar 30 mA. Pengaturan ini dapat dimodifikasi oleh
siapa pun yang melakukan sesuai dengan keperluan dan pengalaman
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
percobaan. Pengaturan tercatat tersebut dipilih karena telah memberikan hasil yang paling baik di antara percobaan-percobaan yang telah dilakukan.
Elektroforesis dilakukan sampai pewarna mencapai bagian dasar gel. Waktu yang diperlukan adalah 55 menit.
Elektroforesis dilakukan terhadap sampel berupa ekstrak ampas biji jinten hitam hasil ekstraksi dengan menggunakan PBS phosphate buffer
saline pH 7,2 dan menggunakan standar berat molekul pembanding marker protein Prestained SDS-PAGE Standars Broad Range dari Bio-
Rad. Hasil SDS - PAGE berdasarkan perhitungan berat molekul sesuai dengan kurva standar protein Lampiran 10.2, menunjukkan bahwa terdapat
beberapa protein yang tampak. Marker protein yang digunakan adalah miosin 250 kDa,
Β-galaktosidase 150 kDa, BSA 75 kDa, Ovalbumin 50 kDa dan soybin tripsin inhibitor 25 kDa. Kurva standar yang dihasilkan dari
marker protein ini memiliki persamaan linier Y = -1,469 X + 2,352; R = 0,971; r = 0,985. Dengan Y adalah log bobot molekul BM dan X adalah Rf
nisbah antara migrasi pita protein sampel dengan migrasi pita protein marker.
Hasil SDS-PAGE, berdasarkan perhitungan berat molekul sesuai dengan kurva standar protein, menunjukkan terdapat beberapa pita protein
yang tampak. Adapun pita protein yang tampak pada sampel supernatan hasil ekstraksi dengan menggunakan PBS phosphate buffer saline pH 7,2
dengan perbandingan sampel yang digunakan 1:1 dan 2:1. Pada perbandingan 2:1 tampak pita protein yang dihasilkan memberikan warna
yang lebih jelas dibandingkan dengan pita protein dari perbandingan 1:1 karena volume pemipetan yang diberikan besar yaitu 20 µl maka jumlah
proteinnya pun menjadi lebih besar. Pita protein yang tampak pada perbandingan 2:1 yaitu 67,4839 kDa - 8,0872 kDa.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1 2 3 4 5
Gambar 4.2. Hasil Analisis SDS-PAGE pada Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam Nigella sativa Linn..
Keterangan gambar : No. 1 = Marker Prestained SDS-PAGE standars Broad Range
No. 2 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 1:1 No. 3 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 1:1
No. 4 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 2:1 No. 5 = Ekstak ampas biji jinten hitam hasil Freeze dry 10 µl 2:1
4.5
Analisis Asam Amino Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam dengan KCKT
Asam amino esensial sangat dibutuhkan oleh manusia karena tidak dapat disintetis sendiri oleh tubuh. Semakin lengkap dan tinggi kandungan
gizi asam amino dalam biji maka nilai gizi semakin baik dan diharapkan dapat menyamai protein hewani Richana, 2000 .
Analisis asam amino dilakukan untuk menduga jenis dan kadar asam amino yang terdapat pada ekstrak ampas biji jinten hitam Nigella sativa
250 kDa 150 kDa
75 kDa
50 kDa
25 kDa
67,4839 47,8410
38,0365 33,9156
30,2413 28,5496
25,4566 20,2396
19,1161 16,0916
15,1985 12,0837
10,7746 10,1718
8,0872
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Linn.. Analisis asam amino diawali dengan hidrolisis. Pada tahap ini, hidrolisis rantai polipeptida yang sempurna dilakukan dengan HCl 6 N pada
suhu 110 C selama 22 jam. Hidrolisis dilakukan dengan HCl karena HCl
dapat memecah ikatan peptida secara sempurna dan dapat dengan mudah hilang dari hidrolisat dengan adanya pengupan Masuda dan Dohmae,
2011. Setelah larutan di hirdolisis, hidrolisat yang diperoleh kemudian didinginkan pada suhu kamar dan ditera volume nya dengan aquabidest.
Setelah itu larutan disaring. Sampel asam amino ditambahkan dengan AABA Alpha amino butyric acid sebagai internal standar dan digenapkan
volumenya dengan aquabidest. Penambahan larutan standar internal digunakan untuk mengoreksi hilangnya residu asam amino selama proses
hidrolisis karena aliran atau penghancuran. Sampel mulai di derivatisasi dengan reagen AQC 6-aminoquinolyl-N-
hidroxysucsinimidil carbamate yang sering dilakukan secara prakolom di ikuti oleh pemisahan fase terbalik KCKT dengan menggunakan detektor
fluoresensi. Penderivat AQC ini merupakan penderivat yang paling stabil jika dibandingkan dengan agen penderivat yang lainnya. Agen penderivat
AQC dapat bereaksi dengan asam amino primer dan asam amino sekunder dan menghasilkan derivat fluoresen dengan eksitasi 250 nm dan emisi 395
nm Bosch et al., 2006 ; Eriksson et al., 2009. Kelebihan reagen AQC dapat bereaksi dengan air dan membentuk 6-aminoquinolin AMQ, N
hidroksi succsinimidi NHS dan karbondioksida CO
2
Salazar et al, 2012. AMQ bereaksi sangat lambat dengan reagen AQC berlebih
membentuk bis aminoquinolin urea. Produk-produk samping tidak mengganggu identifikasi dan kuantifikasi dari salah satu asam amino.
Pengujian asam amino pada ekstrak ampas biji jinten hitam menghasilkan hampir semua jenis asam amino esensial dan non esensial,
kecuali triptofan. Triptofan tidak stabil dalam lingkungan asam, sehingga rusak dalam hidrolisis asam. Dengan hidrolisis asam ini serin dan treonin
akan mengalami kerusakan sebagian, sedangkan asparagin dan glutamin akan terhidrolisa sempurna menjadi asam aspartat dan asam glutamat
dengan membebaskan ion amonium Linder, 1992 ; Sumarno et al., 2002.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Analisis asam amino dengan metode KCKT menunjukkan data kandungan asam amino ekstrak ampas biji jinten hitam Nigella sativa Linn
sebagaimana pada tabel 4.2. Tabel 4.4. Hasil Analisis Kandungan bb Asam Amino dalam
Ekstrak Ampas Biji Jinten Hitam Nigella sativa Linn.
Dari tabel diatas, hasil analisis asam amino dari ampas biji jinten hitam dengan menggunakan KCKT, menunjukkan bahwa ekstrak ampas biji
jinten hitam mengandung 16 asam amino dengan kandungan total 1,055. Diantaranya 9 asam amino esensial, yaitu histidin 0,015, arginin 0,035,
treonin 0,021, valin 0,032, metionin 0,001, lisin 0,182, isoleusin 0,020, leusin 0,030, fenilalanin 0,013; serta 7 asam amino non
esensial, yaitu aspartat 0,058, serin 0,064, glutamat 0,071, glisin 0,053, alanin 0,219, prolin 0,148, dan tirosin 0,005.
Kandungan asam amino esensial yang tertinggi pada ampas biji jinten hitam adalah lisin dengan nilai 0,182. Lisin merupakan asam amino degan
No Asam Amino
Kandungan Asam Amino perlakuan duplo 1
2 Rata-rata
1
Aspartat
0,060 0,055
0,058 2
Serin 0,061
0,067 0,064
3 Glutamat
0,084 0,057
0,071 4
Glisin
0,063 0,043
0,053 5
Histidin 0,016
0,013 0,015
6 Arginin
0,043 0,027
0,035 7
Treonin
0,018 0,025
0,021 8
Alanin 0,330
0,108 0,219
9 Prolin
0,084 0,213
0,148
10 Sistin 0,058
0,118 0,088
11 Tirosin 0,006
0,004 0,005
12 Valin 0,036
0,029 0,032
13 Metionin 0,001
0,001 0,001
14 Lisin 0,154
0,209 0,182
15 Isoleusin 0,021
0,019 0,020
16 Leusin 0,028
0,031 0,030
17 Fenilalnin 0,009
0,017 0,013
Total 1,070
1,037 1,055
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gugus R polar yang digunakan sebagai bahan dasar antibodi darah, memperkuat sistem sirkulasi, mempertahankan pertumbuhan sel-sel normal
bersama prolin dan vitamin C akan membentuk jaringan kolagen, menurunkan kadar trigliserida darah yang berlebih Harli, 2008. Sedangkan
kandungan asam amino non esensial yang tertinggi adalah alanin dengan kandungan 0,219. Alanin merupakan asam amino dengan gugus R
nonpolar yang digunakan sebagai prekursor glukogenik dan pembawa nitrogen dari jaringan permukaan untuk ekskresi nitrogen Linder, 1992.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
