Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.4 Asam Amino

Asam amino merupakan unit dasar struktur protein. Suatu asam amino α terdiri dari gugus amino, gugus karboksil, atom H dan gugus R tertentu, yang semuanya terikat pada atom karbon α. Atom karbon ini disebut α karena bersebelahan dengan gugus karboksil asam. Gugus R menyatakan rantai samping Stryer, 2000. Rumus umum asam amino: Gambar 2.3 Struktur Asam Amino Sumardjo, 2009 Berdasarkan polaritas gugus R, asam amino dibedakan menjadi 4 golongan yaitu 1 asam amino dengan gugus-R yang bersifat non polar, seperti alanin, leusin, isoleusin, valin, prolin, fenilalanin, triftopan, dan metionin, 2 asam amino dengan gugus –R polar tidak bermuatan, seperti serin, treonin, tirosin, aspargin, glutamin, sistein dan glisin, 3 asam amino dengan gugus –R bermuatan positif, seperti lisin, arginin, histidin, dan 4 asam amino dengan gugus –R bermuatan negatif, seperti asam aspartat dan asam glutamat Bodanszky, 1993 ; Sumarno et al., 2002.

2.4.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT

KCKT secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT adalah kromatografi yang dikembangkan menggunakan cairan sebagai fase gerak baik cairan polar maupun cairan non polar, dan bekerja pada tekanan tinggi Adnan 1997. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan suatu cara pemisahan komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta distribusiabsorbsiadsorbsi komponen di antara dua fase yang berbeda, yaitu fase diam stasioner dan fase gerak mobil Salamah, 1997. Pelarut yang biasanya digunakan pada KCKT adalah air, metanol, asetonitril, kloroform, dan pelarut lainnya yang berada dalam keadaan murni HPLC grade. Pelarut-pelarut tersebut sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu dengan kertas saring milipore 0,45 mm dan harus dihilangkan gasnya degassing Salamah, 1997. Komponen utama alat yang dipakai dalam KCKT antara lain 1 reservoir zat pelarut untuk fase mobil; 2 pompa; 3 injektor; 4 kolom; 5 detektor dan 6 rekorder Adnan, 1997. Jantung dari peralatan KCKT adalah kolom dimana terdapat fase diam dan terjadi pemisahan komponen antara fase diam dan fase bergerak yang dialirkan dengan bantuan pompa Salamah, 1997. Alur proses penggunaan KCKT dapat dilihat pada Gambar : Gambar 2.4 Alur proses penggunaan HPLC Husgen dan Schuster, 2001 Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam amino atau kandungan protein dan peptida. Sebelum dilakukan analisis asam amino dengan kromatografi terlebih dahulu dilakukan hidrolisis yang bertujuan untuk memutuskan ikatan peptidanya dengan hidrolisis asam dan basa yang kuat atau dengan menggunakan enzim spesifik untuk mendapatkan asam amino. Pada hidrolisis asam unsur yang dasar yang diperlukan adalah HCl 6 M, suhu 110 C dan waktu 24 jam. Reaksinya biasanya dilakukan di tabung kaca yang ditutup rapat, yang sebelumnya telah dikeluarkan gasnya. Sementara itu, pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus dengan perlakuan terhadap peptida menggunakan NaOH 2M UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada suhu 100 C. Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein, serin, dan treonin Bailey, 1990. Dengan hidrolisis asam, triptofan tidak stabil dalam lingkungan asam, sehingga rusak dalam hidrolisis asam dan sedikit kerusakan juga terjadi pada serin dan treonin, sedangkan asparagin dan glutamin akan terhidrolisa sempurna menjadi asam aspartat dan asam glutamat dengan membebaskan ion amonium Linder, 1992 ; Sumarno et al., 2002. Selain itu, ada pula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk menghancurkan makanan, perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang dapat dikatalisi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal sebagai peptidase. Amino peptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N Bailey, 1990. Pemisahan yang umum dilakukan adalah dengan cara kromatografi. Di antara teknik kromatografi yang dapat dilakukan dengan pemisahan, yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi kertas, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Selain itu, pemisahan asam amino dapat pula dilakukan dengan elektroforesis kertas Bailey, 1990. Kromatografi penukar ion sangat efisien dalam memisahkan campuran asam amino dengan menggunakan kolom penukar ion secara paralel dengan metode deteksi ninhidrin yang hasilnya reprodusibel sehingga teknik ini sangat banyak digunakan dalam pemisahan dan analisis campuran asam amino. Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan asam amino berdasarkan fakta bahwa gugus selulosa kertas memiliki afinitas kuat terhadap molekul air, yang terbentuk oleh ikatan hidrogen dengan gugus OH pada rantai polisakarida. Jika asam amino tidak dapat dipisahkan dengan sempurna dengan kromatografi kertas sederhana, maka kromatogram dua dimensi dapat dicoba Bailey, 1990. KCKT tidak umum digunakan pada pemisahan asam amino Bailey, 1990. Banyak senyawa yang sukar dideteksi oleh detektor KCKT. Salah satu upaya yang dilakukan untuk mengatasi hal tersebut adalah dengan melakukan proses derivatisasi. Derivatisasi dalam KCKT bertujuan untuk mengubah analit menjadi bentuk yang dapat terdeteksi oleh sistem detektor yang digunakan. Proses derivatisasi dapat dilakukan sebelum sampel diinjeksikan pre colomn UIN Syarif Hidayatullah Jakarta derivatization, atau sesudah pemisahan dari kolom post colomn derivatization Adnan, 1997. Metode analisis asam amino dengan KCKT memiliki beberapa keuntungan diantaranya dapat bekerja lebih cepat sehingga waktu yang dibutuhkan singkat serta KCKT mampu memisahkan senyawa yang sangat serupa dengan resolusi yang baik Adnan, 1997. Kelemahan dari metode ini adalah sulitya mendeteksi yang kita inginkan jika sampel yang digunakan memiliki banyak pengotor. Selain itu, kebersihan kolom KCKT harus dijaga, karena kolom yang kotor tidak akan mampu mendeteksi senyawa yang akan dianalisa Husgen dan Schueter, 2001. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3. 1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan dilaboratorium Jurusan Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium Terpadu Kampus UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech, waktu penelitian ini berlangsung dari bulan Januari sampai Agustus 2013. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer UV-VIS ParkinElmer Lambda 25, pH meter, 1 set alat elektroforesis Bio- Rad, mikropipet beserta tipnya, erlenmeyer, labu ukur, sentrifuge beserta tabungnya, peralatan gelas, pinset, spatula, syringe, tabung reaksi, tabung ulir, batang pengaduk, vial, oven, timbangan analitik Wiggen Hauser, pipet volumetrik, vortex, pipet tetes, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi, Laminar Air Flow LAF, 1 set perangkat KCKT Waters tipe Breeze.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ampas biji jinten hitam diperoleh dari PT. Lantabura Internasional, Depok, berasal dari negara Ethiopia, aquabidest, dinatrium hidrogen fosfat, natrium klorida, natriumm dihidrogen posfat, Bovin Serum Albumin BSA, natrium karbonat, natrium hidroksida, CuSO 4 .H 2 O, Na.K-tartrat, pereaksi folin ciocalteu, standar berat molekul protein Bio-Rad Prestained SDS-PAGE Standars, Broad Range 10 kDa-250 kDa, commasie brilliant blue, larutan