Ekstraksi DNA Genom Bakteri

I. BAHAN DAN METODE

2.1 Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri merupakan proses memisahkan koloni-koloni bakteri yang secara morfologi terlihat mendominasi maupun yang unik segi warna, morfologi, dan ukuran dari media pemeliharaan. Udang sampel diambil dari tambak udang PT. Pinang Gading Lampung. Udang sampel ini berasal dari berbagai umur yang berbeda yaitu berumur 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan. Ketiga umur tersebut masing-masing berjumlah 3 ekor dan diambil dari petak tambak yang berbeda. Pengisolasian pertama kali dilakukan dengan pembedahan sampel usus udang vanname Lito penaeus vannamei. Bagian abdomen udang dibedah dan diambil ususnya, usus tersebut dicacah atau dihaluskan dengan menambahkan sedikit akuades . Usus yang telah dihaluskan dilakukan pengenceran dari 10 -1 , sampai 10 -4 dengan larutan Phosphate-Buffered Saline PBS Lampiran 1. Hasil dari pengenceran masing-masing disebar pada media Sea Water Complete SWC yang berada dalam cawan petri. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Koloni bakteri yang secara morfologi terlihat mendominasi maupun yang unik diisolasi untuk diamati keragaman genetik bakterinya. Koloni-koloni yang tampak unik dalam pigmentasi dan morfologinya secara visual juga diambil, kemudian dimurnikan dengan metode kuadran hingga didapatkan koloni bakteri tunggal. Setelah itu koloni bakteri tunggal tersebut diidentifikasi dengan pewarnaan Gram. Adapun metode dan bahan pewarnaan Gram dapat dilihat pada lampiran 2.

2.2 Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ARDRA

2.2.1 Ekstraksi DNA Genom Bakteri

Pengekstraksian DNA dilakukan dengan menggunakan larutan cetyltrimetyl ammonium bromide CTAB modifikasi Murray and Thompson 1980. Isolat bakteri yang telah murni, masing-masing ditumbuhkan dalam media SWC Sea Water Complete cair. Bakteri ditumbuhkan selama 18-24 jam pada suhu 28 o C dalam shaker dengan kecepatan 140-160 rpm. Kemudian bakteri dipanen sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam eppendorf, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit dan supernatannya dibuang. Pelet yang telah mengendap dalam eppendorf dikeringkan dengan membalikkan di atas tisue. Ke dalam tabung yang berisi pelet bakteri ditambahkan 500 µ l 1x TE buffer, kemudian diresuspensi dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan kembali dengan 1x TE buffer sebanyak 500 µ l. Kedalam tabung yang berisi pelet juga ditambahkan 100 µ l lysozym 50 mgµ l dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 jam setiap 15 menit dibolak-balik. Setelah itu ditambahkan 100 µ l SDS 10 dan 10 µ l K- Proteinase diinkubasi lagi pada suhu 37 o C selama 1 jam . Kemudian dimasukkan 100 µ l NaCl 5M dan100 µ l CTAB, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 65 o C selama 20 menit. Selanjutnya ke dalam campuran ditambahkan 500 µ l phenol:chloroform:isoamyl alkohol 25:24:1, divortex selama 30 detik, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam Eppendorf steril yang telah berisi 600 µ l isopropanolethanol absolut dingin -20 o C dan dibolak-balik hingga timbul benang-benang DNA. DNA dalam bentuk pelet dicuci dengan 1 ml ethanol 70 dingin dan dikeringudarakan selama 4-24 jam untuk menguapkan ethanol yang masih tersisa. Langkah terakhir dalam ekstraksi DNA adalah penambahan elution buffer sebanyak 20 – 30 µl dan selanjutnya DNA disimpan pada suhu -20 o C untuk keperluan selanjutnya.

2.2.2 Amplifikasi Gen 16S-rRNA