suhu 28
o
C dalam shaker dengan kecepatan 140-160 rpm. Kemudian bakteri dipanen sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam eppendorf, disentrifugasi
dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit dan supernatannya dibuang. Pelet yang telah mengendap dalam eppendorf dikeringkan dengan membalikkan di atas
tisue. Ke dalam tabung yang berisi pelet bakteri ditambahkan 500 µ l 1x TE buffer, kemudian diresuspensi dan sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5
menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan kembali dengan 1x TE buffer sebanyak 500 µ l. Kedalam tabung yang berisi pelet juga ditambahkan 100
µ l lysozym 50 mgµ l dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam setiap 15 menit dibolak-balik. Setelah itu ditambahkan 100
µ l SDS 10 dan 10 µ l K- Proteinase diinkubasi lagi pada suhu 37
o
C selama 1 jam . Kemudian dimasukkan
100 µ l NaCl 5M dan100 µ l CTAB, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 65
o
C selama 20 menit. Selanjutnya ke dalam campuran ditambahkan 500 µ l
phenol:chloroform:isoamyl alkohol 25:24:1, divortex selama 30 detik, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan
dipindahkan ke dalam Eppendorf steril yang telah berisi 600 µ l
isopropanolethanol absolut dingin -20
o
C dan dibolak-balik hingga timbul benang-benang DNA. DNA dalam bentuk pelet dicuci dengan 1 ml ethanol 70
dingin dan dikeringudarakan selama 4-24 jam untuk menguapkan ethanol yang masih tersisa. Langkah terakhir dalam ekstraksi DNA adalah penambahan elution
buffer sebanyak 20 – 30 µl dan selanjutnya DNA disimpan pada suhu -20
o
C untuk keperluan selanjutnya.
2.2.2 Amplifikasi Gen 16S-rRNA
Sampel DNA sebanyak 0,5 µ l dimasukkan ke dalam tabung PCR yang berisi reagen-reagen PCR yang dicampur. Reagen PCR yang dicampur ini antara
lain 17,5 µ l ddH
2
O, 2,5 µl dNTP 2,5 mM, 2,5 µl Buffer Taq, 0,2 µl enzim DNA Taq Polimerase, 1 µ l primer. Secara umum sampel DNA bakteri pada penelitian
ini menggunakan primer 0008F 5’ AGA GTT TGA TC
M TGG CTC AG 3’ 1.5
µM yang berpasangan dengan primer 1524R 5’ AAG GAG GTG ATC CA
R CCG 3’. Sampel DNA referens menggunakan primer 0008F 5’ AGA GTT TGA
TC M
TGG CTC AG 3’ 1,5 µM yang berpasangan dengan primer 1492RH 5’ G
H T ACC TTG TTA CGA CTT
3’ 1,5 µM Lane, 1991. Sampel DNA bakteri yang tidak dapat teramplifikasi dengan primer 0008F yang berpasangan dengan
1524R, alternatifnya digunakan primer 63F 5’ CAG GCC TAA CAC ATG CAA
GTC 3’ 5 pmol berpasangan dengan 1387R 5’ GGG CGG
W GT GTA CAA
GGC 3’ 5 pmol Marchesi et al. 1998. PCR dilakukan menggunakan PCR
GeneAmp
®
PCR System 2400, Perkin Elmer, USA Lampiran 3. Primer 0008F dan 1524R di PCR dengan kondisi: Pre start 94
o
C 2 menit; denaturasi 92
o
C 2 menit, annealing primer 58
o
C 30 detik, extention 72
o
C 1 menit 20 detik yang dilakukan sebanyak 25 siklus; post PCR 72
o
C 10 menit. Primer 63F dan 1387R di PCR dengan kondisi Pre start 94
o
C 2 menit, denaturasi 92
o
C 2 menit, annealing primer 55
o
C 30 detik, extention 75
o
C 1 menit, yang dilakukan sebanyak 30 siklus; post PCR 72
o
C 20 menit. Primer 0008f dan 1492rh diPCR dengan kondisi Pre start 94
o
C 2 menit; denaturasi 94
o
C 15 detik, annealing primer 50
o
C 30 detik, extention 72
o
C 1 menit 30 detik, ekstra extention 72
o
C 10 menit, yang dilakukan sebanyak 30 siklus; post PCR 10
o
C 10 menit. Setelah itu, suhu diturunkan dan diakhiri pada 4
o
C.
2.2.3 Digesti dengan Enzim Restriksi Sau3AI
Hasil amplifikasi gen 16S-rRNA dari masing-masing sampel dipotong dengan menggunakan enzim restriksi
Sau3AI 5’-↓GATC EU, PureExtreme™
Fermentas .
Setiap reaksi pemotongan terdiri atas 6 µ l hasil PCR gen 16S- rRNA, 1,5 µl buffer enzim restriksi 10X, 0,15 µl enzim restriksi [10 unit µ l], dan
7,5 µl ddH
2
O. Selanjutnya setiap tabung yang berisi reaksi di atas, diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 16 jam. Hasil pemotongan kemudian dielektroforesis dengan kondisi 150 V 80 mA, sampai ± 45 menit. Setelah proses elektroforesis
selesai, gel diamati di atas lampu UV transiluminator dan didokumentasi untuk melihat pola ARDRA. Pola ARDRA ini dijadikan data biner sebagai input untuk
konstruksi pohon filogenetika.
2.2.4 Elektroforesis
