Botol yang berisi media kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit. Media yang aman digunakan adalah media yang telah disimpan dalam inkubator selama
kurang lebih 1 minggu dan tidak tampak adanya pertumbuhan mikroorganisme kontaminan seperti : jamur, dan bakteri.
4. Sterilisasi alat dan ruangan
a. Sterilisasi alat
Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan alumuniumfoil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang
dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan pada temperatur 120
°C selama 20 menit. b. Sterilisasi ruangan
Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow LAF disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 atau spiritus.
Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF dinyalakan selama ± 2 jam.
5. Sterilisasi dan penanaman eksplan
a. Sterilisasi eksplan
Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir
dengan diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat di permukaan terluar eksplan Eksplan direndam-dikocok dalam larutan
hipoklorit dan Tween-80 selama 5 – 10 menit kemudian dibilas dengan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
akuades. Di dalam LAF eksplan juga disterilkan dengan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit-Tween-80 selama 5 menit. Eksplan dibilas 3 kali
dengan air steril air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf. Eksplan yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.
b. Penanaman eksplan
Potongan eksplan yang akan ditanam yang sudah disterilkan sebelumnya dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan untuk
memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur. Media yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan
suhu ruangan 18 °C serta disinari dengan lampu TL ”Day Light” 20 watt
dengan ketinggian 40 cm.
6. Pengamatan waktu inisiasi kalus
Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu
inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada bagian pelukaan eksplan.
7. Subkultur
Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman dimana tanaman telah menampakkan gejala kurang nutrisi berwarna kecoklatan atau bobotnya
tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi bagian yang lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses subkultur ini
dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset, skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70 dan botol-botol yang
berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air flow
dan disterilkan selama ± 2 jam dengan lampu UV. Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70
kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan
pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong
dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset dengan ukuran kalus awal, yaitu 3 – 5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis.
Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 18
C serta disinari dengan lampu TL “Day Light” 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 42
botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan
dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus.
8. Pemanenan
