21
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian noneksperimental yang menggunakan rancangan penelitian deskriptif. Termasuk jenis penelitian
noneksperimental karena subyek penelitian tidak diberi perlakuan, dengan rancangan deskriptif karena peneliti hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.
B. Variabel dan Definsi Operasional
1. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi konsentrasi campuran parasetamol dan kafein.
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah konsentrasi sampel parasetamol dan kafein.
c. Variabel pengacau dari penelitian ini adalah pengukuran absorbansi yang tidak informatif. Dikendalikan dengan pengukuran pada rentang panjang
gelombang tertentu.
2. Definisi Operasional
a. Set kalibrasi merupakan kelompok larutan yang berisi campuran
parasetamol dan kafein yang digunakan untuk membuat model kalibrasi. b.
R
2
atau R-sq merupakan koefisien determinasi yang menggambarkan kemampuan nilai sebenarnya dalam menjelaskan hubungan terhadap nilai
terhitung.
c. RMSE root mean square of error merupakan standar deviasi dari sebuah
pemodelan yang menjelaskan seberapa besar kesalahan suatu model dalam memprediksikan sampel.
d. PRESS predicted error of sum square merupakan nilai kesalahan yang
dilakukan oleh model saat memprediksikan sampel pada proses validasi silang leave one-out.
C. Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku parasetamol PT. Combiphar dan baku kafein PT. Konimex yang didapat dari
industri farmasi dengan grade working standards, pelarut yang digunakan adalah akuabidestilata, sediaan obat yang mengandung campuran parasetamol dan kafein
yang dibeli dari apotek di Yogyakarta, kertas saring.
D. Alat Penelitian
Alat –alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat–alat gelas
untuk preparasi sampel seperti labu takar ukuran 10 mL, 50 mL, 100 mL, botol pelarut, gelas ukur ukuran 100 mL, glass firn, pipet volume 1 mL, 2mL, 5mL,
micropipette skala 20 –200 µL, micropipette skala 100-1000 µL merk Socorex,
degasser Retsch UR-275, neraca analitik merk Ohauss PAJ1003 dengan kepekaan 0,1 mg maksimal 120 gram, minimal 0,001 gram, spektrofotometer UV merk
Shimadzu UV-1800, kuvet kuarsa merk Hellma.
E. Tata Cara Penelitian
1. Scanning spektra standar Scanning standar dilakukan dengan membuat standar parasetamol dan kafein
dengan konsentrasi 5 µgmL dan dilakukan scanning spketra pada panjang gelombang 220-400 nm.
2. Pemilihan interval pengukuran dan panjang gelombang pengukuran untuk set kalibrasi
a. Dilakukan pengamatan spektra dari hasil pengukuran campuran standar parasetamol dan kafein. Dipilih rentang panjang gelombang saat campuran
senyawa mulai memberikan serapan sampai campuran memberikan serapan mendekati nilai 0.
b. Rentang panjang gelombang yang dipilih adalah 220-310 nm. Interval pengukuran yang dipilih adalah 2 nm agar diperoleh data pengamatan dalam
jumlah yang cukup untuk dapat menggambarkan hubungan variabel. 3. Preparasi larutan set kalibrasi
a. Standar parasetamol dan kafein ditimbang seksama ± 50 mg dan
dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, ditambahkan pelarut akuabidestilata sambil dilarutkan, kemudian diencerkan sampai batas tanda,
sehingga didapat larutan stok dengan konsentrasi 500 μgmL.
b. Dibuat larutan antara parasetamol dan kafein dengan cara mengencerkan
larutan stok hingga konsentrasi 100 µgmL. Diambil 5,0 mL larutan stok parasetamol, dimasukkan dalam labu takar 25 mL ditambahkan dengan
pelarut akuabidestilata sampai batas tanda. Diambil 5,0 mL larutan stok
kafein dimasukkan dalam labu takar 25 mL ditambahkan pelarut akuabidestilata hingga batas tanda. Sehingga didapat larutan antara dengan
konsentrasi 100 µgmL. c.
Dibuat 20 larutan set kalibrasi, dengan cara setiap larutan antara dipipet sejumlah tertentu kemudian dimasukkan kedalam labu takar 10 mL dan
ditambahkan pelarut akuabidestilata hingga batas tanda, sehingga konsentrasi yang diperoleh sesuai dengan tabel I untuk larutan set kalibrasi.
d. Setiap larutan c diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang
gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm.
Tabel I. Komposisi campuran parasetamol PCT dan kafein CAF untuk model kalibrasi.
No PCT
µgmL CAF
No PCT
µgmL CAF
µgmL µgmL
1 6,4
1,0 11
5,1 0,6
2 5,8
0,6 12
4,1 1,1
3 4,3
0,6 13
7,0 1,0
4 5,7
0,8 14
7,4 0,7
5 7,0
0,8 15
6,9 0,8
6 4,5
0,5 16
8,1 0,9
7 6,9
1,0 17
7,6 0,8
8 5,5
0,9 18
8,0 0,8
9 6,3
0,6 19
5,3 0,5
10 7,2
1,1 20
5,8 0,5
Konsentrasi dibuat berdasarkan bilangan acak sesuai dengan nilai
perbandingan kekuatan senyawa dalam tablet dengan menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2007.
4. Preparasi larutan set validasi a. Masing
–masing standar parasetamol dan kafein ditimbang seksama ± 50 mg dan dimasukkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan sebagian
pelarut akuabidestilata, kemudian diencerkan sampai batas tanda larutan stok validasi dengan konsentrasi 500
μgmL.
b. Dilakukan pembuatan larutan antara dengan mengencerkan masing-masing larutan stok validasi hingga konsentrasi 100
μgmL. Diambil 5,0 mL larutan stok parasetamol dilarutkan ke dalam labu takar 25 mL, ditambahkan
dengan akuabidestilata sampai batas tanda. Diambil 5,0 mL larutan stok kafein dilarutkan ke dalam labu takar 25 mL, dan diencerkan dengan
akuabidestilata sampai batas tanda. c. Dibuat larutan set validasi, dengan cara, sejumlah tertentu larutan antara
dipipet, dimasukkan dalam labu takar 10 mL kemudian ditambahkan akuabidestilata hingga diperoleh konsentrasi sesuai tabel II.
d. Setiap larutan c diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm.
Tabel II. Komposisi campuran parasetamol PCT dan kafein CAF untuk validasi
No PCT
μgmL CAF
μgmL 1
7,7 1,2
2 4,5
1,3 3
5,5 1,1
4 4,1
0,8 5
7,0 0,6
6 8,2
0,7 7
5,3 1,3
8 6,3
1,0 9
5,1 0,9
10 4,3
0,8
5. Analisis sampel
a. Ditimbang 20 sampel tablet secara seksama, dicatat bobot setiap tablet,
dilakukan pengujian keseragaman bobot tablet, digerus sampai homogen. b.
Ditimbang seksama dengan jumlah tertentu yang setara dengan 50 mg parasetamol dan 6,5 mg kafein dilarutkan dalam labu takar 100 mL,
dilarutkan dalam sebagian pelarut akuabidestilata, diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai batas tanda. Larutan disaring
menggunakan kertas saring. c.
Dari larutan yang telah disaring, dipipet sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan dalam labu takar 50 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda.
d. Dari larutan d tersebut dipipet lagi sebanyak 2,0 mL dan dimasukkan
dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda. e.
Dilakukan scanning dari larutan tersebut pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval absorbansi 2 nm.
f. Dilakukan penetapan kadar parasetamol dan kafein sebanyak 6 kali. Kadar
dihitung dengan metode kalibrasi multivariat partial least square PLS.
6. Pengolahan data secara statistik dengan kalibrasi multivariat partial least square PLS
a. Model Kalibrasi Multivariat PLS.
1 Data konsentrasi dan absorbansi kelompok larutan kalibrasi yang
disajikan dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dipindahkan ke dalam kertas kerja Minitab® 16 dengan fungsi copy-
paste. 2
Pengolahan data statistik partial least square PLS dipilih dengan menggunakan pilihan Stat pada panel kerja Minitab 16, kemudian dipilih
regression partial least square. 3
Setelah muncul jendela baru dari program Minitab 16, dilakukan pembuatan model PLS parasetamol dengan cara; kolom response diisi
dengan pilihan variabel konsentrasi PCT dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm. Untuk
pembuatan model PLS kafein dibuat dengan cara; kolom response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi CAF dan kolom model dipilih
variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm. 4
Diperoleh nilai terhitung dan nilai sebenarnya dari model kalibrasi multivariat PLS parasetamol dan kafein, nilai tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dengan fungsi copy-paste.
5 Akurasi dan presisi dievaluasi dengan dicari nilai R
2
dan nilai RMSEC dengan dibuat hubungan linier antara konsentrasi dan absorbansi.
Diperoleh nilai R
2
serta persamaan linier y=bx+a. persamaan linier dipakai untuk menentukan nilai RMSEC.
b. Cross Validation Leave-one-out
1 Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel
dengan menggunakan fungsi copy-paste ke dalam kertas kerja Minitab 16.
2 Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada panel
kerja, kemudian dipilih regression partial least square. 3
Proses validasi model kalibrasi dilakukan dengan, dimasukan variabel konsentrasi PCT ke dalam response dan variabel absorbansi ke dalam
kolom model
.
Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya ditentukan tambahan proses leave-one-out. Perlakuan sama diberlakukan
untuk proses validasi CAF. 4
Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS dari tahap validasi internal dan selanjutnya dipindahkan ke dalam kertas kerja
perangkan lunak Microsoft Excel dengan fungsi copy-paste. 5
Akurasi dan presisi model kalibrasi ditinjau dari nilai R
2
dan nilai RMSECV dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya dan
nilai terhitung. Diperoleh persamaan linear y=bx+a hubungan antara nilai sebenarnya dan terhitung yang nantinya akan digunakan untuk
memperoleh nilai RMSECV.
7. Anasilis data a.
Akurasi dan presisi model kalibrasi multivariat parasetamol dan kafein dinyatakan secara statistik dengan nilai R
2
, RMSEC, RMSECV, dan PRESS.
b. Konsentrasi sampel dihitung dengan koefisien dari masing-masing model
untuk senyawa parasetamol dan kafein sesuai dengan rumus : 7
Keterangan : X = Konsentrasi terhitung sampel µgmL
t
s
= koefisien dari model kalibrasi = absorbansi dari masing-masing pengukuran sampel
= koreksi kesalahan yang mungkin terjadi pada model kalibrasi PLS
c. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan rumus :
Keterangan : Ct = konsentrasi sampel terprediksi oleh model µgmL
Fp = Faktor Pengenceran = Berat rata-rata penimbangan keseluruhan sampel tablet
mgtab X = Berat penimbangan sampel mg
Tab = Berat rata
–rata sampel yang telah diuji keseragaman bobot, sehingga diasumsikan sebagai bobot persatuan tablet. 8
d. Kadar =
=
e. Akurasi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan persen perolehan
kembali dengan rentang yang dapat diterima menurut Herrador dan Gonzales 2007 adalah sebesar 90-107
f. Presisi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan nilai RSD dengan
nilai maksimal yang masih dapat diterima menurut Gonzales dan Herrador 2007 adalah sebesar 8.
31
1. BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Analisis Secara Spektrofotometri UV yang Dikombinasikan dengan Kalibrasi Multivariat
Tahap awal pada penelitian ini adalah melakukan scanning baku parasetamol dan kafein secara tunggal maupun campuran dari baku parasetamol
dan kafein. Hal ini dilakukan untuk melihat overlapping yang terjadi dari kedua komponen tersebut. Gambar 7
memperlihatkan overlapping spektra yang terjadi pada campuran parasetamol dan kafein.
Gambar 7. Overlay spektra UV parasetamol PCT, kafein CAF, dan campuran parasetamol dan kafein pada konsentrasi 5 µgmL, yang diukur pada panjang
gelombang 220-400 nm
Seperti ditunjukkan Gambar 7, dapat dilihat bahwa terjadi tumpang tindih antara spektrum parasetamol dan kafein. Sehingga analisis kuantitatif
menggunakan spektrofotometri UV secara simultan untuk kedua senyawa tersebut tidak dapat dilakukan. Tetapi dengan berkembangnya kemometrika permasalahan
tersebut dapat diatasi. Dengan penggunaan metode spektrofotometri yang
CAF PCT
Camp PCT dan CAF
dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat dapat dilakukan penetapan masing –
masing komponen tersebut secara simultan tanpa pemisahan. Selain melakukan scanning antara baku dan campuran baku juga
dilakukan scanning terhadap sampel dan campuran baku untuk melihat kemiripan antara sampel dan campuran baku, seperti ditunjukkan pada Gambar 8. Hal ini
juga untuk melihat apakah ada eksipien pada sampel yang memberikan serapan pada panjang gelombang parasetamol dan kafein, dari gambar 8 dapat dilihat
bahwa tidak terdapat serapan dari eksipien pada panjang gelombang parasetamol dan kafein.
Gambar 8. Overlay campuran parasetamol PCT dan kafein CAF dan sampel yang mengandung parasetamol PCT dan kafein CAF pada panjang gelombang
Kalibrasi multivariat partial least square PLS digunakan untuk melakukan pengolahan data absorbansi. Partial least square PLS digunakan
untuk melakukan pengolahan data karena mampu menghasilkan model kalibrasi dengan kemampuan prediksi yang baik untuk jumlah data yang banyak. Data
absorbansi dari 20 set kalibrasi disiapkan sebagai model kalibrasi diukur pada
Sampel Campuran baku
PCT dan CAF
220 - 400 nm
B. Optimasi Kalibrasi Multivariat Menggunakan Partial Least Square PLS
Kategori