Analisis parasetamol, kafein, dan propifenazon dengan metode spektrofotometri UV dan kemometrika tanpa tahap pemisahan.
ANALISIS PARASETAMOL, KAFEIN, DAN PROPIFENAZON DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV DAN
KEMOMETRIKA TANPA TAHAP PEMISAHAN Arief Dzulfianto
118114157
INTISARI
Metode analisis obat untuk penetapan kadar adalah spektofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS. Metode ini mampu menetapkan kadar senyawa multikomponen yang mempunyai masalah
overlapping pada spektra UV.
Metode spektrofotomeri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan.Tiga model campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein akan dioptimasi untuk analisis menggunakan spektrofotometri UV dan kalibrasi multivariat PLS. Model kalibrasi akan dibuat dengan membuat 20 campuran sintetik dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 220-313 nm dengan interval 3 nm. Kemudian dievaluasi berdasarkan koefisien determinasi (R2), kesalahan pemodelan kalibrasi root mean square error of calibration (RMSEC) dan kesalahan pemodelan kalibrasi pada validasi root mean square error of
calibration validation (RMSECV).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS dapat digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan. Nilai koefisien determinasi untuk hubungan antara konsentrasi sebenarnya dengan konsentrasi terprediksi tanpa validasi silang leave one out pada parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 0,9994 ; 0,9878; 0,9919 dengan nilai RMSEC 0,027; 0,082; 0,043 dan nilai koefisien determinasi dengan validasi silang leave one out 0,997; 0,983; 0,982 dengan nilai RMSECV 0,062; 0,095; 0,982. Nilai presentase kedekatan kadar terhitung dengan kadar dalam etiket untuk parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 90,70%; 90,49%; 103,38%.
(2)
ANALYSIS PARACETAMOL, CAFFEINE, AND
PROPHYPHENAZONE WITH SPECTROPHOTOMETRIC UV AND CHEMOMETRIC WITHOUT SEPARATION
Arief Dzulfianto 118114157
ABSTRACT
The method analysis of drug for assay is a UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS. This method can to assay for analysis multicomponent drug have a problem of overlapping in spektra UV.
The method UV spectrophotometric couple with multivariate calibration partial least square (PLS) has been developed for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. Three mixture model paracetamol, propifenazone, and caffeine will be optimized for analysis using UV spectrophotometric and PLS multivariate calibration. The calibration model is prepared by developing a series 20 mixture of synthetic and measured absorbance at a wavelength of 220-313 nm with an interval of 3 nm. The evaluation of calibration model will be relied on coefficient of determination (R2), root mean
square error of calibration (RMSEC) and root mean square error of calibration validation (RMSECV).
The results showed that UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS can be used for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. The coefficient of determination for the relationship between the actual consentration with predicted concentration without the leave-one-out cross validation on paracetamol, propifenazone, and caffeine is 0.9994; 0.9878; 0.9919 with RMSEC value 0.027; 0.082; 0.043 and the coefficient of determination with a leave-one-out cross validation 0.997; 0.983; 0.982 for RMSECV value 0.062; 0.095; 0.982. Percentage recovery for paracetamol, propifenazone, and caffeine is 90,70%; 90,49%; 103,38%.
(3)
ANALISIS PARASETAMOL, KAFEIN, DAN PROPIFENAZON DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KEMOMETRIKA TANPA
TAHAP PEMISAHAN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh : Arief Dzulfianto NIM : 118114157
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2015
(4)
i
ANALISIS PARASETAMOL, KAFEIN, DAN PROPIFENAZON DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KEMOMETRIKA TANPA
TAHAP PEMISAHAN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh : Arief Dzulfianto NIM : 118114157
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2015
(5)
ii
(6)
(7)
iv
Halaman Persembahan
Everybody is a genius. But if you judge a fish by its
ability to climb a tree it will live its whole life believing
that it is stupid
-
Albert Einstein –
TERUNTUK
Allah SWT yang Maha Pemberi Petunjuk dan Pemberi
Kemudahan di segala Hal
Keluarga yang selalu memberikan dukungan dan doa
(8)
v
(9)
(10)
vii
PRAKATA
Puji Syukur dan terima kasih kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat dan karunia– NYA sehingga Skripsi dengan judul “Analisis Parasetamol, Kafein, dan Propifenazon dengan Metode Spektrofotometri UV dan Kemometrika tanpa Tahap Pemisahan“ ini dapat diselesaikan dengan baik.
Selama menulis Skripsi ini, penulis menyadari bahwa ada begitu banyak pihak yang telah berkontribusi besar dalam proses pengerjaan Skripsi ini. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku dekan Universitas Sanata Dharma
2. Prof. Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing utama yang dengan penuh kesabaran memberikan masukan, ilmu, perhatian, dan support yang telah diberikan dari awal penelitian hingga selesainya Skripsi ini.
3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing pedamping yang juga memberikan semangat, bimbingan, kritik dan saran kepada penulis agar Skripsi ini selesa dengan baik.
4. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen pembimbing akademik yang memberikan dukungan dan semangat kepada penulis dalam proses pengerjaan skripsi ini dan selama menjalankan studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
(11)
viii
5. Dosen penguji yang akan memberikan kritik dan saran yang akan membuat penulisan naskah ini menjadi lebih baik.
6. PT. Konimex yang telah bersedia memberikan bahan baku standart parasetamol, kafein, dan propifenazon untuk dianalisis dalam pembuatan skripsi ini.
7. Mas Bimo dan Pak Kethul selaku staff Laboratorium Kimia Analisis Instrumental yang telah memberikan banyak kemudahan kepada penulis dalam proses penelitian ini.
8. Bapak, Ibu, Mas Shodiq, Mbak Citra, Hanif untuk segala doa, dukungan, motivasi dan perhatian kepada penulis selama pembuatan skripsi ini.
9. Kakak Ipar yang selalu menyediakan makanan agar penulis tidak kelaparan saat pembuatan naskah skripsi ini.
10.Ade, Jalaq, Erfan, Opphi, Devina selaku rekan sekelompok skripsi yang sudah berjuang bersama dan membantu dalam proses penelitian skripsi ini.
11.Teman–teman FST B 2011 yang selalu memberikan semangat dalam pembuatan skripsi.
12.Arinda Sulistyawati, Ade Savitri atas kebersamaan yang selalu memberikan support, mengajak travelling agar penulis tidak stress dalam pengerjaan proses skripsi ini.
13.Ary, Alva, Alip, Dajal, Ampau, Alpin, Tepe, Eka, Emre sebagai sahabat yang selalu memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis dalam proses pembuatan skripsi ini
(12)
ix
14.BIGFAM yang selalu memberikan support kepada penulis dalam pembuatan skripsi.
15.Seluruh Crew Unik Merchandise yang memberikan semangat dalam pembuatan skripsi.
16.Seluruh teman, baik di Universitas Sanata Dharma maupun di luar yang selalu memberikan semangat dan dukungan dalam pembuatan skripsi.
17.Semua pihak yang membantu penulis selama proses penelitian hingga selesainya skripsi, yang tidak dapat penulis sebutkan satu – persatu.
Penulis menyadari bahwa tugas akhir ini masih memiliki banyak kekuangan dan ketidak sempurnaan, maka itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak.
Akhir kata, semoga penilitian skripsi yang penulis lakukan dapat bermanfaat bagi perkembangan di dunia kefarmasian.
Yogyakarta, 10 Desember 2015 Penulis
(13)
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ii
HALAMAN PENGESAHAN iii
HALAMAN PERSEMBAHAN iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI vi
PRAKATA vii
DAFTAR ISI x
DAFTAR TABEL xiii
DAFTAR GAMBAR xv
DAFTAR LAMPIRAN xviii
DAFTAR SINGKATAN xx
INTISARI xxi
ABSTRACT xxii
BAB I PENGANTAR 1
A. Lalar Belakang 1
1. Perumusan masalah 3
2. Keaslian Penelitian 3
3. Manfaat penelitian 4
B. Tujuan Penelitian 4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA 6
(14)
xi
1. Parasetamol 6
2. Kafein 7
3. Propifenazon 8
B. Spektrofotometri UV/VIS 8
C. Analisis Multikompeen secara Spektrofotometri UV 10
1. Kemungkinan pertama 11
2. Kemungkinan kedua 11
3. Kemungkinan ketiga 12
D. Kemometrika 13
E. Validasi Metode Analisis Kalibrasi Multivariat 15
1. Presisi 16
2. Akurasi 18
3. Selektivitas 19
F. Landasan Teori 19
G. Hipotesis 21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 22
A.Jenis dan Rancangan Penelitian 22
B.Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 22
1. Variabel 22
2. Definisi Operasional 22
C.Bahan Penelitian 23
D.Alat Penelitian 23
(15)
xii
1. Scanning spektra standar 24
2. Pemilihan interval pengukuran dan panjang gelombang pengukuran
untuk set kalibrasi 24
3. Penyiapan larutan set kalibrasi dan set validasi eksternal 24
4. Uji keseragaman bobot tablet 26
5. Analisis sampel 27
6. Analisis statistik kalibrasi multivariat (PLS) 27
a. Model kalibrasi multivariat PLS 27
b. Cross validation leave one-out 28
7. Analisis data sampel 29
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 32
A. Analisis parasetamol, propifenazon, kafein secara simultan menggunakan
metode spektrofotometri UV 32
B. Optimasi kalibrasi multivariat menggunakan partial least square (PLS) 34 C. Validasi model kalibrasi multivariat PLS 38
1. Validasi silang (cross validation) 39
2. Validasi eksternal 45
D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi 47
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 50
A. Kesimpulan 50
B. Saran 51
(16)
xiii
LAMPIRAN 55
(17)
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD 18
Tabel II. Nilai % recovery 19
Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol, propifenazon, dan
kafein untuk model kalibrasi 25
Tabel IV. Komposisi campuran sintetik paracetamol Parasetamol, Kafein, Propifenazon untuk validasi eksternal 26
Tabel V. Nilai konsentrasi sebenarnya (actual response) vs konsentrasi terhitung (calculated response) menggunakan spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm 34
Tabel VI. Hasil persamaan , R2, dan RMSEC yang didapat dari hubungan antara nilai kadar sebenarnya (actual value) vs nilai terhitung (calculated value) dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada
panjang gelombang 220-313 nm 37
Tabel VII. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi pls dari sampel yang dilakukan validasi silang (cross validation) yang mengandung parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), dan
(18)
xv
Tabel VIII. Evaluasi nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari 10 larutan set validasi yang mengandung parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), dan kafein (KAF). 44
Tabel IX. Rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri
UV- PLS 45
Tabel X. Hasil penetapan kadar prediksi parasetamol dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
49
Tabel XI. Hasil penetapan kadar prediksi propifenazon dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
49
Tabel XII. Hasil penetapan kadar prediksi kafein dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS 50
(19)
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur kimia paracetamol 6
Gambar 2. Struktur kimia kafein 7
Gambar 3. Struktur kimia propifenazon 8
Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam 10
Gambar 5. Spektrum absorbsi tidak saling tumpang tindih 11
Gambar 6. Spektrum absorpsi tumpang tindih satu arah 12
Gambar 7. Spektrum absorpsi tumpang tindih dua arah 12
Gambar 8. Spektra Uv parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF), dan spektra Uv campuran PCT, PROPI, dan KAF yang diukur pada panjang gelombang 220-400 nm 32
Gambar 9. Spektra Uv sampel sediaan farmasi (tablet) dan spektra Uv campuran baku parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF) yang diukur pada panjang gelombang 200-400 nm. 33
Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) parasetamol dengan metode spektrofotometri UV – PLS pada panjang
(20)
xvii
Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) propifenazon dengan metode spektrofotometri UV – PLS pada panjang
gelombang 220 -313 nm 36
Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) kafein dengan metode spektrofotometri UV – PLS pada panjang gelombang 220 -313
nm. 36
Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang parasetamol dengan
teknik leave one- out 40
Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang propifenazon dengan
teknik leave one-out 40
Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang kafein dengan teknik
leave one-out 41
Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respons) hasil validasi silang leave one-out dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm 42
Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respons) hasil validasi
(21)
xviii
silang leave one-out dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm 42
Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respons) hasil validasi silang leave
one-out dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang
gelombang 220-313 nm 43
Gambar 19. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi dalam pelarut akuabides pada panjang gelombang 220-313 nm 48
(22)
xix
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Keseragaman Bobot 56
Lampiran 2. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one-out 57
Lampiran 3. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) propifenazon dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one-out 58
Lampiran 4. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) kafein dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa
validasi silang leave one-out 59
Lampiran 5. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one-out. 60
Lampiran 6. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) propifenazon dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one-out 61
Lampiran 7. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) kafein dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one-out 63
(23)
xx
Lampiran 8. Data pengukuran absorbansi kurva baku dengan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-313 nm
64
Lampiran 9. Data pengukuran absorbansi sampel dengan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-313 nm 66
Lampiran 10. Perhitungan kadar parasetamol pada sampel tablet menggunakan hasil koefisien validasi silang 68
Lampiran 11. Perhitungan kadar propifenazon pada sampel tablet menggunakan hasil koefisien validasi silang 70
Lampiran 12. Perhitungan kadar kafein pada sampel tablet menggunakan hasil koefisien validasi silang 72
Lampiran 13. Sertifikat analisis baku kafein 74
Lampiran 14. Sertifikat analisis baku propifenazon 75
(24)
xxi
DAFTAR SINGKATAN
PCT : parasetamol
PROPI : propifenazon
KAF : kafein
UV : ultraviolet
VIS : visible
R2 : koefisien determinasi
RMSEC : root mean square error of calibration RMSECV : root mean square error of cross validation RMSEP : root mean square error of prediction PRESS : predicted residual sum of squares PLS : partial least square
(25)
xxii
INTISARI
Metode analisis obat untuk penetapan kadar adalah spektofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS. Metode ini mampu menetapkan kadar senyawa multikomponen yang mempunyai masalah
overlapping pada spektra UV.
Metode spektrofotomeri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan.Tiga model campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein akan dioptimasi untuk analisis menggunakan spektrofotometri UV dan kalibrasi multivariat PLS. Model kalibrasi akan dibuat dengan membuat 20 campuran sintetik dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 220-313 nm dengan interval 3 nm. Kemudian dievaluasi berdasarkan koefisien determinasi (R2), kesalahan pemodelan kalibrasi root mean square error of calibration (RMSEC) dan kesalahan pemodelan kalibrasi pada validasi root mean square error of
calibration validation (RMSECV).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS dapat digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan. Nilai koefisien determinasi untuk hubungan antara konsentrasi sebenarnya dengan konsentrasi terprediksi tanpa validasi silang leave one out pada parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 0,9994 ; 0,9878; 0,9919 dengan nilai RMSEC 0,027; 0,082; 0,043 dan nilai koefisien determinasi dengan validasi silang leave one out 0,997; 0,983; 0,982 dengan nilai RMSECV 0,062; 0,095; 0,982. Nilai presentase kedekatan kadar terhitung dengan kadar dalam etiket untuk parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 90,70%; 90,49%; 103,38%.
(26)
xxiii
ABSTRACT
The method analysis of drug for assay is a UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS. This method can to assay for analysis multicomponent drug have a problem of overlapping in spektra UV.
The method UV spectrophotometric couple with multivariate calibration partial least square (PLS) has been developed for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. Three mixture model paracetamol, propifenazone, and caffeine will be optimized for analysis using UV spectrophotometric and PLS multivariate calibration. The calibration model is prepared by developing a series 20 mixture of synthetic and measured absorbance at a wavelength of 220-313 nm with an interval of 3 nm. The evaluation of calibration model will be relied on coefficient of determination (R2), root mean
square error of calibration (RMSEC) and root mean square error of calibration validation (RMSECV).
The results showed that UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS can be used for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. The coefficient of determination for the relationship between the actual consentration with predicted concentration without the leave-one-out cross validation on paracetamol, propifenazone, and caffeine is 0.9994; 0.9878; 0.9919 with RMSEC value 0.027; 0.082; 0.043 and the coefficient of determination with a leave-one-out cross validation 0.997; 0.983; 0.982 for RMSECV value 0.062; 0.095; 0.982. Percentage recovery for paracetamol, propifenazone, and caffeine is 90,70%; 90,49%; 103,38%.
(27)
1
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Salah satu obat yang digunakan luas di masyarakat adalah obat sakit kepala, dan sakit gigi seperti campuran parasetamol, kafein, dan propifenazon. Saat ini banyak obat sakit kepala dan sakit gigi beredar di masyarakat luas, campuran parasetamol, kafein, dan propifenazon banyak tersedia dalam bentuk sediaan tablet dengan berbagai merek dagang (Tan & Rahardja, 2007).
Dalam ilmu farmasi, pemeriksaan mutu obat mutlak diperlukan agar obat dapat sampai pada targetnya dengan kadar yang tepat. Adanya pengembangan metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat dapat menganalisis senyawa multikomponen yang memiliki spektra UV overlapping (Danzer et al, 2004).
Spektrofotometri UV-VIS biasanya hanya digunakan untuk menganalisis satu senyawa saja. Saat ini dengan berkembangnya perangkat lunak yang semakin modern dan teknologi semakin canggih, perangkat lunak komputer terutama analisis multivariat, spektrofotometri UV-VIS digunakan untuk menganalisis campuran beberapa senyawa obat secara simultan dengan menggabungkan spektrofotometri UV-VIS dengan kalibrasi multivariat seperti “kemometrika” merupakan teknik yang baik dan
(28)
sederhana untuk analisis suatu analit dalam campuran seperti parasetamol, propifenazon, dan kafein.
Dilihat dari senyawa yang akan dianalisis, parasetamol pada larutan asam mempunyai panjang gelombang maksimal di sekitar 245 nm dengan nilai = 688a, pada larutan alkali 257 nm = 715b, kafein dalam air asam mempunyai λmaks 273nm dan mempunyai nilai sebesar
504a, kafein tidak mempunyai λmaks pada air basa, dan propifenazon dalam air asam λmaks 240nm mempunyai nilai sebesar 400a; dalam air basa
λmaks 245 , 265nm mempunyai nilai sebesar 385b (Moffat, et al.,
2011). Hal ini bisa dilihat bahwa ketiga senyawa ini akan saling tumpang tindih atau overlapping, maka perlu adanya pendekatan metode kalibrasi multivariat “kemometrika” untuk analisis parasetamol, kafein, dan propifenazon.
Penelitian yang telah berhasil dalam penetapan kadar menggunakan metode spekrofotmetri UV-VIS yang digabungkan dengan metode kalibrasi multivariat kemometrik adalah untuk analisis kombinasi obat untuk pereda rasa nyeri adalah penetapan kadar parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat secara simultan (Ardiyanti, 2014).
Penggunaan metode spektrofotometri UV-VIS dengan pendekatan metode kalibrasi multivariat kemometrika untuk analisis kombinasi parasetamol, kafein, dan propifenazon dalam sediaan farmasi (tablet) akan dilakukan pada penelitian ini.
(29)
1. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang sudah diuraikan di atas, maka permasalahan yang muncul adalah :
a. Bagaimana kondisi optimum metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat PLS untuk analisis sediaan tablet parasetamol, kafein, dan propifenazon? b. Bagaimana validasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan
dengan kalibrasi multivariat untuk analisis campuran parasetamol, kafein, dan propifenazon?
c. Bagaimana aplikasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat untuk penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam sediaan farmasi tanpa tahap pemisahan ?
2. Keaslian Penelitian
Yang sudah pernah dilaporkan untuk analisis senyawa multikomponen dengan spektrofotometri UV yang dikombinasikan kalibrasi multivariat secar simultan adalah :
a. Kombinasi spektrofotometri UV dan kalibrasi multvariat untuk analisis parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat secara simultan (Ardiyanti, 2014).
b. Analisis sulfametoksazol dan trimetropim secara spektrofotometri UV dan trimetropim secara simultan tanpa tahap pemisahan (Khotimah, 2014).
(30)
Hasil penelusuran publikasi – publikasi ilmiah menunjukkan bahwa analisis campuran parasetamol, kafein, dan propifenazon secara simultan dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri UV–Vis yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat belum pernah dilaporkan. 3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Metodelogis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif metode analisis untuk menetapkan kadar Parasetamol, kafein, dan propifenazon dalam sediaan farmasi yang memenuhi persyaratan validitas yang baik.
b. Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah mengenai validasi metode penetapan kadar Parasetamol, kafein, dan propifenazon dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri UV–Vis.
c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk menetapkan kadar campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein dalam sediaan farmasi yang banyak beredar di pasaran.
B. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui optimasi metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat PLS untuk analisis sediaan tablet parasetamol, kafein, dan propifenazon.
(31)
2. Mengetahui validasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat untuk analisis campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein tanpa tahap pemisahan.
3. Mengetahui aplikasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat untuk penetapan kadar campuran parasetamol, propifenazon, kafein tanpa tahap pemisahan.
(32)
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Kombinasi Obat Pereda Nyeri
Parasetamol dan Propifenazon merupakan obat yang secara luas digunakan dalam penanganan rasa nyeri (analgetika) dan demam (antipiretika). Kafein sering dikombinasikan dengan Parasetamol dan Propifenazon untuk memperkuat efek analgetiknya melalui mekanisme vasokonstriktif guna untuk mengobati nyeri kepala. Karena terjadi efek potensiasi, maka dosis masing–masing komponennya diturunkan sehingga efek samping dapat dikurangi (Tan & Rahardja, 2007).
1. Parasetamol
Struktur parasetamol dapat dilihat pada Gambar 1 memiliki rumus kimia C8H9NO2 (BM. 151,2) berbentuk kristal atau serbuk berkristal, larut dalam air 1 g dalam 70 mL (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1979); larut dalam etanol, metanol, dimetilformamid, etilen diklorid, aseton, dan etil asetat; sangat sedikit larut dalam kloroform; sedikit larut dalam eter; praktis tidak larut dalam petroleum eter, pentana, dan benzen.
(33)
Gambar 1. Struktur kimia parasetamol
Spektrum UV parasetamol pada larutan asam mempunyai panjang gelombang maksimal di sekitar 245 nm dengan nilai = 688a, pada larutan alkali 257 nm = 715b (Moffat, et al., 2004).
2. Kafein
Struktur Kafein dapat dilihat pada Gambar 2 memiliki rumus kimia C8H10N4O2(BM. 194,2) berbentuk kristal putih atau serbuk kristal putih.
Gambar 2. Struktur kimia kafein
Titik didih pada 238ºC. Ketika dikristalisasi dari air, kafein mengandung 1 molekul air dari hasil kristalisasi, tapi bebas dari air ketika dikristalisasi menggunakan etanol, kloroform atau eter. Larut pada pirol, pada tetrahidrofuran yang mengandung ± 4% air; larut pada etil asetat; larut 1 g dalam 46 mL air, 1 g dalam 5,5 mL air pada suhu 80ºC, 1 g dalam 1,5 mL air mendidih, 1 g dalam 66 mL alkohol, 1 g dalam 22 mL alkohol pada
(34)
suhu 60ºC, 1g dalam 50 mL aseton, 1 g dalam 5,5 mL kloroform, 1 g dalam 530 mL eter, 1 g dalam 100 mL benzen, 1 g dalam 22 mL benzen mendidih, sedikit larut dalam petroleum eter. Kelarutan dalam air dapat ditingkatkan menggunakan benzoat , sinamat, sitrat atau salisilat. pKa kafein 10,4 (40º). Dalam air asam mempunyai λmaks 273 nm dengan nilai sebesar 504a. Tidak memiliki λmaks pada air basa (Moffat, et al., 2011).
3. Propifenazon
Struktur propifenazon dapat dilihat pada Gambar 3 memiliki rumus kimia (C14H18N2O) berbentuk bubuk kristal berwarna putih.
Gambar 3. Struktur kimia propifenazon
Titik didih 103ºC, Larut dalam air 1 g / 400 mL ; sangat larut dalam etanol dan kloroform; larut dalam eter. Dalam air asam λmaks 240 nm mempunyai nilai sebesar 400a ; dalam air basa λmaks 245 nm , 265 nm mempunyai nilai sebesar 385b (Moffat, et al., 2011)
B. Spektrofotometri UV/VIS
Serapan radiasi digunakan dalam analisis spektrofotometri UV-VIS dan inframerah. Spektrofotometri UV adalah anggota teknis analisis spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet
(35)
dekat (190-380 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman,1995).
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi (atom, ion, atau molekul). Interaksi yang menyebabkan adanya perpindahan energi dari sinar radiasi ke materi disebut absorbsi (Pecsok et al, 1976). Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan strukur dari molekul. Setiap senyawa mempunyai tingkatan energi yang spesifik (Mulja dan Suharman,1995).
Sinar UV memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Keadaan paling rendah disebut keadaan dasar (ground state). Transisi–transisi elektronik akan meningkatkan energi molekular dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi. Jika molekul dikenai radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai dan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi disebut orbital elektron anti ikatan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Spektrofotometer double beam merupakan alat pengembangan dari spektrofotometer single beam karena keterbatasan yang dimiliki oleh spektrofotometer single beam. Spektrofotometer double beam dapat dilihat dibawah pada Gambar 4.
(36)
Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam
Spektrofotometer double beam memiliki dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang digunakan untuk memecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blanko dan sinar kedua melewati sampel, dengan dilakukannya sistem ini maka spektrofotometer double beam dapat mengkoreksi perubahan respon absorbansi akibat perbedaan intensitas cahaya, fluktuasi pada kelistrikan instrumen dan absorbansi blanko (Haven, Tetrault, and Schenken, 1994).
C. Analisis Multikomponen secara Spektrofotometri UV Apabila dua atau lebih komponen mempunyai absorbansi pada panjang gelombang yang sama dan keduanya tidak saling bergantung satu sama lain maka pengukuran spektrofotometri memberikan harga penjumlahan absorbansi dari setiap komponen (Swarbick, 1997). Prinsip tersebut dapat digunakan dalam analisis multikomponen dengan cara mencari absorbansi atau beda absorbansi tiap – tiap komponen yang akan memberikan korelasi yang linier terhadap konsentrasi, sehingga dapat
(37)
dihitung masing–masing kadar campuran tersebut secara serentak atau salah satu komponen dalam campurannya dengan komponen yang lainya (Mulja dan Suharman, 1995).
Menurut Day and Underwood (2002), ada tiga kemungkinan profil spektrum absorpsi yang dihasilkan dari dua komponen campuran yaitu:
1.
Kemungkinan pertamaSpektra tanpa tumpang tindih atau sekurangnya dimungkinkan untuk menemukan suatu panjang gelombang yang mana x menyerap dan y tidak, serta panjang gelombang serupa untuk mengukur y. Konstituen x dan y diukur masing – masing pada panjang gelombang λ1 dan λ2 seperti dilihat pada Gambar 5 :
Gambar 5. Spektrum absorpsi pada panjang gelombang masing – masing komponen tidak saling tumpang tindih (Day dan Underwood, 2002)
2. Kemungkinan kedua
Spektra tumpang tindih satu arah, y tidak menganggu pengukuran x pada λ1, tetapi x menyerap cukup banyak bersama–sama y pada λ2. Konsentrasi x ditetapkan dan absorbansi larutan pada λ1. Absorbansi yang diberikan oleh konsentrasi x pada λ2 dihitung pada absorptivitas molar x
(38)
pada λ2. Absorbansi ini dikurangkan dari absorbansi terukur larutan pada λ2 sehingga akan diperoleh absorbansi yang disebabkan oleh y, konsentrasi y dapat diukur dengan cara yang lazim, seperti dilihat pada Gambar 6 :
Gambar 6. Spektrum absorpsi tumpang tindih satu arah (Day dan Underwood, 2002)
3. Kemungkinan ketiga
spektra tumpang tindih dua arah. Bila tidak ditemukan panjang gelombang yang mana x atau y menyerap secara eksklusif, maka perlu memecahkan dua persamaan serempak dengan dua derivative. Analisis kuantitatif jenis ini dapat dilakukan dengan aplikasi metode panjang gelombang berganda atau derivative, seperti dilihat pada Gambar 7 :
Gambar 7. Spektrum absorpsi tumpang tindih dua arah (Day dan Underwood, 2002)
(39)
D. Kemometrika
Menurut International Chemometrics Society (Kumpulan ahli kemometrika internasional), kemometrika adalah ilmu pengetahuan yang menghubungkan pengukuran yang dibuat pada suatu proses atau sistem kimiawi melalui penggunaan ilmu matematika dan statistika. Dari sini dapat diketahui bahwa ilmu matematika dan statistika mendukung pemahaman kemometrika. Kemometrika dikenalkan ke dalam spektroskopi untuk meningkatkan kualitas data yang diperoleh. Meskipun, pada awal penggunaannya hanya untuk mengolah data spektra, akan tetapi saat ini kemometrika memungkinkan untuk memperlakukan sejumlah besar informasi yang berasal dari konsentrasi komponen sampel dalam jangka waktu yang cepat (Rohman, 2014).
Metode–metode analisis farmasi seperti spektroskopi mampu memberikan sejumlah data beberapa komponen secara simultan dalam satu kali pembacaan sampel. Situasi semacam ini, yang mana beberapa variabel (parameter) diukur untuk tiap sampel akan menghasilkan data multivariat. Diantara jenis kalibrasi multivariat, teknik kalibrasi classical least squares (CLS), stepwise multiple linear regression (SMLR), principle component
regression (PCR), dan partial least square (PLS) merupakan jenis yang
paling sering digunakan (Rohman, 2012).
Kalibrasi classical least squares (CLS) didasarkan pada hukum Beer yang mana absorbansi pada setiap panjang gelombang proporsional terhadap konsentrasi komponen. Kalibrasi principle component regression
(40)
(PCR) dan partial least squares (PLS) termasuk jenis Inverse Least square (ILS) (Rohman, 2012).
PLS mampu memprediksi secara lebih baik daripada PCR ketika ada baseline linier yang acak dan atau spektra komponen utama yang tumpang tindih (Sohrabi et al., 2009). Dalam PLS, variabel yang menunjukkan korelasi tinggi dengan variabel respon lebih dipilih karena lebih efektif untuk mempredisi. Kombinasi linier variabel prediktor dipilih dari yang memiliki korelasi tinggi dengan variabel respon dan dapat menjelaskan variasi dalam variabel prediktor (Miller dan Miller, 2010).
Kalibrasi PCR Merupakan analisis faktor yang mana hanya spektra yang tidak memberi ko-linieritas yang digunakan dalam kalibrasi. PCR mengaplikasikan teknik multivariat analisis komponen utama atau principal
component analysist (Che Man et al., 2010). Sementara itu, kalibrasi PLS
merupakan jenis regresi yang dihitung dengan algoritma kuadrat terkecil yang menghubungkan antara dua matriks, data spektra pada matriks X dan nilai referens pada matriks Y. PLS sering digunakan dalam spektroskopi untuk mengekstrak informasi dari spektra yang mengandung puncak-puncak yang tumpang suh, adanya pengganggu, serta adanya derau (noise) dari instrumen yang digunakan untuk mengumpulkan data (Syahariza et al., 2005).
Kalibrasi PCR dan PLS dilakukan dalam 3 tahap yaitu : (1) kalibrasi; (2) validasi; dan (3) analisis sampel yang tidak diketahui (Osborne
(41)
yang diikuti validasi (dengan validasi sampel secara terpisah atau dengan validasi silang tengan teknik leave one out) dan tahap prediksi (sampel baru). Jika hasil tahap kalibrasi dan validasi yang digunakan memenuhi kriteria (korelasi yang tinggi, kesalahan yang kecil) maka model yang dikembangkan selanjutnya digunakan untuk mengestimasi konsentrasi campuran dari sampel yang belum diketahui konsentrasinya
Kalibrasi PLS merupakan kalibrasi terbalik (inverse calibration) dimana sumbu x (absorbansi) dan sumbu y (konsentrasi) dengan menggunakan validitas yaitu root mean square error of calibration (RMSEC), root mean square error of prediction (RMSEP) dan koefisien determinasi (R2). Selanjutnya model PLS diujisilangkan menggunakan teknik “leave one out”. Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi
dikeluarkan dari model PLS dan sisa sampel yang ada digunakan untuk pemodelan dengan PLS. Sampel yang dihilangkan selanjutnya dihitung dengan model PLS baru yang dikembangkan. Prosedur tersebut dilakukan berulang kali, menghilangkan satu demi satu sampel kalibrasi hingga didapatkan harga R2 mendekati 1 (Rohman and Cheman, 2011). Menurut El Gindy (2006), pemilihan panjang gelombang pada PLS diperlukan supaya kinerja model dapat optimum meskipun metode ini secara komputerisasi dapat menghitung seluruh spektrum.
E. Validasi Metode Analisis Kalibrasi Multivariat
Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk mebuktikan bahwa metode analisis tersebut secara taat
(42)
asas memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai. Persoalan analisis era modern ini yaitu sangat kecilnya kadar senyawa yang dianalisis dan kompleksnya matrik sampel yang dianalisis (Mulja dan Suharman,1995).
Validasi metode analisis merupakan suatu persyaratan dasar untuk menjamin kualitas dan kehandalan hasil dari semua aplikasi metode analisis (Ermer dan Miler, 2005).
1. Presisi
Presisi suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian antara hasil pengukuran ketika metode tersebut diaplikasikan secara berulang-ulang pada sampel yang homogen. Presisi biasanya ditunjukkan dengan standar deviasi atau koefisien variasi dari sebuah seri pengukuran (Anonim,2005). Presisi dalam USP dibagi menjadi tiga macam yaitu :
a. Repeatability adalah derajat keterulangan metode analisis jika
analisis dilakukan di laboratorium yang sama pada hari yang sama dengan alat yang sama pula.
b. Intermediate precision adalah derajat keterulangan metode analisis
jika analisis dilakukan pada laboratorium yang sama dengan hari yang berbeda, analisis yang berbeda dan atau alat yang berbeda. c. Reproducibility adalah derajat keterulangan metode analisis jika
analisis dilakukan pada laboratorium yang berbeda (Anonim, 2005).
(43)
Presisi suatu prosedur analisis menunjukkan kedekatan nilai (derajat penyebaran) antara serangkaian pengukuran yang dilakukan dari proses multiple sampling dari sekumpulan sampel homogen dengan kondisi yang telah ditentukan.
Presisi seringkali diekspresikan dengan simpangan baku (SD) atau simpangan baku relatif (RSD) dari serangkaian data. Perhitungan RSD menggunakan rumus :
X
x 100% (1)
Keterangan : SD = simbangan baku serangkaian data
X = Rata – rata data
(Gandjar dan Rohman, 2007) Ketidakpastian kalibrasi dan prediksi kadar yang tidak diketahui dihitung dengan standard error of calibration (SEC) dan standard error of
prediction (SEP). Parameter lain untuk mengukur presisi kalibrasi
multivariat adalah nilai predictive residual error sum of squares (PRESS). PRESS dihitung seperti menghitung SEP dengan menggunakan sampel validasi (Danzer et al., 2004).
Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang untuk kadar analit 100%. Kriteria tersebut sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel,dan kondisi laboratorium seperti pada Tabel I.
(44)
Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD Analit % Fraksi analit Konsentrasi
analit Nilai RSD (%)
100 1 100% 2
10 10-1 10% 2,8
1 10-2 1% 4
0,1 10-3 0,10% 5,7
0,01 10-4 100 ppm 8
0,001 10-5 10 ppm 11,3
0,0001 10-6 1 ppm 16
0,00001 10-7 100 ppb 22,6
0,000001 10-8 10 ppb 32
0,0000001 10-9 1 ppb 45,3
(Horwitz cit. Gonzales, Herrador, and Asuero, 2010).
2. Akurasi
Akurasi suatu metode analisis merupakan kedekatan hasil pengukuran yang diperoleh dengan metode tersebut dengan nilai yang sebenarnya. Akurasi suatu metode analisis sebaiknya disajikan dalam rentang (Anonim, 2005).
%Recovery =
x 100% (2)
Akurasi dinyatakan sebagai persen kembali analit yang ditambahkan dan nilai kecermatan dapat dinyatakan dengan persen perolehan kembali (% recovery). Batasan nilai akurasi dapat dilihat pada Tabel II (Wood, 1998)
(45)
Tabel II. Nilai % recovery (Wood, 1998)
Analit pada matrix sampel (%) Recovery yang diterima (%)
100 98 – 102
>10 98 – 102
>1 97 – 103
>0,1 95 – 105
0,01 90 – 107
0,001 90 – 107
0,0001 (1 ppm) 80 – 110
100 ppb 80 – 110
10 ppb 60 – 115
1 ppb 40 – 120
Ada tidaknya suatu kesalahan sistematik dapat diketahui dari fungsi
recovery. Dalam kalibrasi multivariat kadar yang diprediksi model (Ĉ)
dikorelasikan dengan kadar aktual sampel validasi (c) dengan persamaan regresi sebagai berikut :
Ĉ =
Koefisien regresi ideal jika nilai = 0 dan = 1 (Danzer, et al, 2004). 3. Selektivitas
Secara umum, selektivitas sistem multikomponen dapat ditetapkan secara kualitatif dan kuantitatif. Dalam kalibrasi multivariat, selektivitas biasanya dihitung dengan condition number. Namun condition number tidak memperhitungkan kadar masing masing komponen dan hanya memberikan baasan besarnya kesalahan yang diperbolehkan (Danzer et al, 2004).
(46)
F. Landasan Teori
Dalam sediaan obat sering digunakan campuran zat aktif untuk memperoleh efek teraupetik yang lebih baik. Salah satunya adalah campuran Parasetamol, Kafein, Propifenazon (Tan & Rahardja, 2007).
Penelitian ini merupakan analisis senyawa multikomponen sehingga untuk mengatasi overlapping spektra UV yang dihasilkan maka digunakan kombinasi kalibrasi multivariat untuk pengolahan data dan validasi metode dilakukan dengan paramater akurasi dan presisi (Danzer et
al, 2004).
Sifat kelarutan dari ketiga zat aktif tersebut mirip. Parasetamol larut larut dalam air 1 g/ 70 mL. Kafein larut dalam air 1 g/46 mL. Propifenazon larut dalam air 1 g/400 mL. Parasetamol, Kafein, Propifenazon masing– masing dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri UV- VIS. Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada 245 nm dan serapan maksimum dalam larutan basa pada 257 nm, kafein memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada 273 nm, propifenazon memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada 240 nm (Moffat, et
al., 2004). Dengan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang
yang berdekatan tersebut menyebabkan spektrum serapan ketiga senyawa tumpang tindih. Metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kemometrika dapat digunakan sebagai alat analisis untuk ketiga senyawa yang tumpang tindih tersebut.
(47)
Keberhasilan analisis menggunakan spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat dilihat dari koefisien determinasi (R2) >0,99 , RMSEP (root mean square error of prediction) dan RMSECV (root mean square error of cross validation) yang kecil (El-Gindy et al., 2006).
G. Hipotesis
1. Spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS memiliki kemampuan prediksi yang optimal untk senyawa parasetamol, kafein, dan propifenazon.
2. Spektrofotometri UV-VIS yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS merupakan metode yang valid untuk senyawa parasetamol, kafein, dan propifenazon.
3. Spektrofotometri UV-VIS yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar senyawa campuran parasetamol, kafein, propifenazon dalam sediaan tablet oral memiliki akurasi dan presisi yang baik.
(48)
22
BAB III
METODELOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini termasuk penelitian noneksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel
a. Variabel Bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah Konsentrasi larutan campuran model kalibrasi.
b. Variabel Tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah Konsentrasi sampel sediaan farmasi.
c. Variabel Pengacau. Variabel pengacau dari penelitian ini adalah pengukuran data absorbansi yang tidak informatif. Dikendalikan dengan pemusatan pengukuran pada panjang tertentu.
2. Definisi Operasional
a. R-sq atau R2 merupakan koefisien determinasi yang menggambarkan kemampuan nilai konsentrasi dalam menjelaskan hubungan terhadap nilai terhitung..
b. RMSE (root mean square of error) merupakan stadar deviasi dari sebuah pemodelan yang menjelaskan seberapa mungkinsuatu model kalibrasi melakukan kesalaan saat memprediksikan sampel.
(49)
c. PRESS (predicted error sum of square) merupakan nilai kesalahan yang dilakukan saat prediksi sampel oleh model kalibrasi dalam proses cross validation leave-one-out.
d. Set kalibrasi merupakan 20 larutan kalibrasi yang didapat dari
randomisasi menggunakan ms.excel 2010 untuk pembuatan model kalibrasi multivariat PLS untuk senyawa
e. Set validasi merupakan 10 larutan kalibrasi yang didapat dari
randomisasi menggunakan ms.excel 2010 untuk pembuatan model kalibrasi multivariat PLS untuk senyawa
C. Bahan Penelitian
Bahan–bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku parasetamol (PT. Combiphar), baku kafein (PT. Konimex), dan baku propifenazon (PT. Konimex), akuabides, kertas saring dan sediaan tablet yang mempunyai komposisi zat aktif parasetamol 250 mg, propifenazon 150 mg, dan kafein 50 mg.
D. Alat Penelitian
Spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu) tipe UV 1800 dengan kuvet kwarsa 1 cm merk Hellma, mikropipet 200 µL dan 1000 µL merk Socorex,
degasser Retsch UR-275, neraca merk Ohaus PAJ1003 dengan kepekaan 0,1 mg
(maksimal 120 g, minimal 0,001 g), serta alat-alat gelas yang lazim digunakan dalam laboratorium analisis kimia yang terdapat di laboratorium instrumen analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
(50)
E. Tata Cara Penelitian
Penelitian ini menetapkan kadar parasetamol, propifenazon, kafein dalam sediaan tablet kombinasi secara spektrofotometri UV yang dihubungkan dengan kalibrasi multivariat tanpa tahap pemisahan.
Analisis secara spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat dilakukan dengan cara :
1. Scanning spektra standar
Scanning standar dilakukan dengan membuat standar parasetamol dan
kafein dengan konsentrasi 5 µg/mL dan dilakukan scanning spketra pada panjang gelombang 220-400 nm.
2. Pemilihan interval pengukuran dan panjang gelombang pengukuran untuk
set kalibrasi
a. Dilakukan pengamatan spektra dari hasil pengukuran campuran standar parasetamol, propifenazon, dan kafein. Dipilih rentang panjang gelombang saat campuran senyawa mulai memberikan serapan sampai campuran memberikan serapan mendekati nilai 0 b. Rentang panjang gelombang yang dipilih adalah 220-310 nm. Interval
pengukuran yang dipilih adalah 3 nm agar diperoleh data pengamatan dalam jumlah yang cukup untuk dapat menggambarkan hubungan variabel.
3. Penyiapan larutan set kalibrasi dan set validasi eksternal
a. Standar parasetamol, propifenazon, kafein masing–masing ditimbang secara seksama 50 mg, dimasukkan dalam labu takar 100 mL,
(51)
dilarutkan dengan pelarut akuabides, diultrasonifikasi selama 10 menit, dan ditambahkan dengan pelarut sampai batas tanda.
b. Pembuatan 20 larutan set kalibrasi dan 10 set validasi , dilakukan dengan cara: setiap larutan antara dipipet sejumlah tertentu, dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan diencerkan dengan pelarut akuabides hingga diperoleh kadar sesuai Tabel III untuk set kalibrasi dan Tabel IV untuk set validasi eksternal.
Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol, propifenazon, dan kafein untuk model kalibrasi
No Parasetamol
(µg/mL)
Propifenazon (µg/mL)
Kafein (µg/mL)
1 5,8 3,5 1,5
2 7,1 3,1 1,2
3 5,2 3,4 0,5
4 6,6 4,7 0,6
5 4 4,3 0,7
6 6,1 3,6 0,8
7 5,6 4,4 2
8 3,9 3,9 0,9
9 6,3 2,1 1,8
10 3,8 2,3 1
11 7 3,6 2
12 6,8 2,9 1,9
13 4,5 4,4 1,4
14 6,4 2,6 0,7
15 5 3,6 1,2
16 7,3 16 1,6
17 6,1 2,4 0,8
18 6,3 4,7 1,2
19 4,5 3,6 1,2
(52)
Tabel IV. Komposisi campuran sintetik paracetamol Parasetamol, Kafein, Propifenazon untuk validasi eksternal
No Parasetamol (µg/mL)
Propifenazon (µg/mL)
Kafein (µg/mL)
1 5,9 4,6 1,7
2 7,8 3,6 1,3
3 6,3 2 1,8
4 4,8 3,2 0,7
5 7,6 4,1 2
6 5,8 2,9 1,9
7 6,7 3,3 0,8
8 7,2 2,7 1,2
9 8,4 3,7 1
10 4,9 3,7 1,1
4. Uji keseragaman bobot tablet
Sejumlah 20 sediaan tablet, dihitung bobot rata-rata tiap tablet. Sediaan tablet memenuhi syarat apabila ditimbang satu per satu, tidak ada lebih dari 2 tablet yang menyimpang dari bobot rata-rata lebih besar dari 5% dan tidak ada satu tablet pun yang bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).
5. Analisis Sampel
a. Ditimbang 20 sampel tablet secara seksama, dicatat bobot setiap tablet, dilakukan pengujian keseragaman bobot tablet, digerus sampai homogen. b. Ditimbang seksama dengan jumlah tertentu yang setara dengan 25 mg
parasetamol, 15 mg propifenazon, dan 5 mg kafein dilarutkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dalam sebagian pelarut akuabides, diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai batas tanda. Larutan disaring menggunakan kertas saring.
(53)
c. Dari larutan yang telah disaring, dipipet sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan dalam labu takar 50 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda.
d. Dari larutan (c) tersebut dipipet lagi sebanyak 2,0 mL dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda.
e. Dilakukan scanning dari larutan tersebut pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval absorbansi 3 nm.
f. Dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein sebanyak 6 kali. Kadar dihitung dengan metode kalibrasi multivariat
partial least square (PLS).
6. Analisis statistik kalibrasi multivariat (PLS)
a. Model Kalibrasi Multivariat PLS
1) Data konsentrasi dan absorbansi kelompok larutan kalibrasi yang disajikan dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dipindahkan ke dalam kertas kerja Minitab® 16 (trial) dengan fungsi
copy-paste.
2) Pengolahan data statistik partial least square (PLS) dipilih dengan menggunakan pilihan Stat pada panel kerja Minitab 16, kemudian dipilih regression partial least square.
3) Setelah muncul jendela baru dari program Minitab 16, dilakukan pembuatan model PLS parasetamol dengan cara; kolom response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi PCT dan kolom model
(54)
dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm. Untuk pembuatan model PLS kafein dibuat dengan cara; kolom
response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi CAF dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310
nm.
4) Diperoleh nilai terhitung dan nilai sebenaryna dari model kalibrasi multivariat PLS parasetamol dan kafein, nilai tersebut kemudian dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dengan fungsi copy-paste.
5) R2 didapat dari hubungan korelasi atau kedekatan nilai antara nilai sebenarnya (sumbu X) dengan nilai terhitung (sumbu Y).
6) RMSEC dapat dihitung menggunakan rumus √∑
dimana x
adalah nilai sebenarnya (actual), y adalah nilai terhitung (calculated), dan n adalah banyak nya data konsentrasi yang dirandomisasi yaitu 20.
b. Cross Validation Leave-one-out
1) Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dengan menggunakan fungsi copy-paste ke dalam kertas kerja Minitab 16.
2) Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada panel kerja, kemudian dipilih regression partial least square.
3) Proses validasi model kalibrasi dilakukan dengan, dimasukan variabel konsentrasi PCT ke dalam response dan variabel
(55)
absorbansi ke dalam kolom model. Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya ditentukan tambahan proses leave-one-one. Perlakuan sama diberlakukan untuk proses validasi CAF.
4) Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS dari tahap validasi internal dan selanjutnya dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkan lunak Microsoft Excel dengan fungsi
copy-paste.
5) Akurasi dan presisi model kalibrasi ditinjau dari nilai R2 dan nilai RMSECV dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung. Diperoleh persamaan linear y=bx+a hubungan antara nilai sebenarnya dan terhitung yang nantinya akan digunakan untuk memperoleh nilai RMSECV.
7. Anasilis data Sampel
a. Akurasi dan presisi model kalibrasi multivariat parasetamol dan kafein dinyatakan secara statistik dengan nilai R2, RMSEC, RMSECV, RMSEP dan PRESS.
b. Konsentrasi sampel dihitung dengan koefisien dari masing-masing model untuk senyawa parasetamol dan kafein sesuai dengan rumus :
Keterangan :
X = Konsentrasi terhitung sampel (µg/mL) ts = koefisien dari model kalibrasi
(56)
= koreksi kesalahan yang mungkin erjadi pada model kalibras PLS
c. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan rumus :
̅ )
Keterangan :
Ct = konsentrasi sampel terprediksi oleh model (µg/mL) Fp = Faktor Pengenceran
̅ = Berat rata-rata penimbangan keseluruhan sampel tablet (mg (tab)) X = Berat penimbangan sampel (mg)
d. Akurasi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan persen perolehan kembali dengan rentang yang dapat diterima menurut Wood (1998) adalah sebesar 90-107%
e. Presisi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan nilai RSD dengan nilai maksimal yang masih dapat diterima menurut Gonzales dan Herrador (2007) adalah sebesar 11,3%.
Analisis kalibrasi multivariat dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Minitab® 16 (trial). Kertas kerja perangkat lunak Excel 2010 digunakan untuk menentukan konsentrasi secara random masing–masing zat aktif dan untuk menghubungkan antara konsentrasi sebenarnya dan konsentrasi yang ditemukan atau terprediksi.
(57)
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Analisis parasetamol, propifenazon, kafein secara simultan menggunakan metode spektrofotometri UV
Spektra UV parasetamol, propifenazon, kafein dengan konsentrasi masing-masing 5 ppm dapat dilihat pada Gambar 8 dari gambar ini nampak bahwa ketiga senyawa mempunyai spektra yang overlapping. Dengan bekembangnya teknologi, saat ini tersedia suatu perangkat kalibrasi multivariat yang dapat mengatasi masalah spektra yang overlapping seperti ini.
Gambar 8. Spektra UV parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF), dan spektra UV campuran PCT, PROPI, dan KAF yang diukur pada panjang
gelombang 220-400 nm
PCT PROP
KAF Spektra Uv campuran PCT, PROPI, dan KAF
(58)
Untuk suksesnya analisis ketiga senyawa ini (PCT, PROPI, dan KAF) dengan bantuan kalibrasi multivariat kemometrika, maka spektra UV sampel yang akan di analisis harus mempunyai spektra UV yang mirip dengan spektra UV baku, karena jika spektra baku campuran ketiga senyawa obat dengan sampel sediaan farmasi yang akan dianalisis tidak mirip, maka perlu diperhatikan adanya bahan tambahan dalam sampel yang membuat spektra tidak mirip dengan baku. Dari Gambar 9 nampak bahwa sediaan farmasi (tablet) dan campuran baku ketiga senyawa (PCT, PROPI, dan KAF) mempunyai pola spektra yang mirip.
Gambar 9. Spektra UV sampel sediaan farmasi (tablet) dan spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF)
yang diukur pada panjang gelombang 200-400 nm
Spektra campuran baku (PCT, PROPI, dan KAF)
Spektra sampel sediaan farmasi (tablet)
(59)
B. Optimasi kalibrasi multivariat menggunakan partial least
square (PLS)
Partial least square (PLS) digunakan untuk melakukan pengolahan
data karena mampu menghasilkan model kalibrasi dengan kemampuan prediksi yang baik untuk jumlah data yang banyak. Data absorbansi dari 20
set kalibrasi disiapkan sebagai model kalibrasi diukur pada panjang
gelombang 220-313 nm dengan interval panjang gelombang 3 nm. Pada
partial least square (PLS) dilakukan pemilihan panjang gelombang, hal ini
bertujuan untuk memperoleh kinerja model yang optimum meskipun pada metode partial least square (PLS) secara komputerisasi dapat mencakup seluruh spektrum (El Gindy, 2006).
Kebaikan suatu model kalibrasi dapat dilihat dari nilai koefisien determinasi (R2) dan nilai RMSEC (root mean square error of calibration). Hasil dari analisis varian untuk senyawa parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah nilai p = 0,000 menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara kedua variabel dalam hal ini konsetrasi dan absorbansi. Selisih antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung yang dihasilkan sangat kecil yang menunjukkan pengukuran yang dilakukan oleh model kalibrasi baik, kemudian diproses menggunakan Microsoft Excel untuk menentukan nilai R2 dan nilai RMSEC.
Sebagaimana dalam analisis instrumental pada umumnya, maka tahapan pertama yang dilakukan adalah menyiapkan model kalibrasi dengan membuat campuran yang terdiri dari parasetamol, propifenazon, dan kafein
(60)
dengan komposisi konsentrasi obatnya sebagaimana dalam Tabel V yang merupakan hasil pengolahan data yang diperoleh dari pembuatan model kalibrasi parasetamol, propifenazon, dan kafein. Konsentrasi sebenarnya adalah konsentrasi yang dibuat berdasarkan bilangan acak pada tahap pembuatan set kalibrasi, sedangkan konsntrasi terhitung merupakan konsentrasi yang diprediksikan oleh model kalibrasi PLS.
Tabel V. Nilai konsentrasi sebenarnya (actual response) vs konsentrasi terhitung (calculated response) menggunakan spektrofotometri UV-PLS tanpa
cross validation pada panjang gelombang 220-313 nm N
o
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,8 5,77066 3,5 3,51837 1,5 1,47959
2 7,1 7,05251 3,1 2,89564 1,2 1,29613
3 5,2 5,20979 3,4 3,54848 0,5 0,41901
4 6,6 6,59923 4,7 4,68976 0,6 0,61707
5 4 3,9998 4,3 4,3271 0,7 0,66428
6 6,1 6,15229 3,6 3,60682 0,8 0,78476
7 5,6 5,62027 4,4 4,48832 2,0 1,96576
8 3,9 3,88761 3,9 3,91042 0,9 0,90564
9 6,3 6,30969 2,1 2,14829 1,8 1,76964
10 3,8 3,79138 2,3 2,33285 1 1,00518
11 7 7,01089 3,6 3,67687 2 1,9727
12 6,8 6,78876 2,9 2,86851 1,9 1,89113
13 4,5 4,50794 4,4 4,23057 1,4 1,48311
14 6,4 6,43501 2,6 2,64747 0,7 0,68175
15 5 4,99175 3,6 3,58413 1,2 1,22162
16 7,3 7,29625 3,2 3,18993 1,6 1,63279
17 6,1 6,07108 2,4 2,32971 0,8 0,83733
18 6,3 6,23926 4,7 4,62668 1,2 1,24191
19 4,5 4,52631 3,6 3,56571 1,2 1,20179
20 7,2 7,23951 3,4 3,51437 1,9 1,82882
Sampel kalibrasi ini selanjutnya dimodelkan dengan menggunakan kalibrasi multivariat partial least square (PLS). Parasetamol dimodelkan
(61)
pada panjang gelombang 313 nm. Pemilihan panjang gelombang 220-313 nm bertujuan untuk mengurangi sebagian data yang mungkin bersifat tidak informatif dan untuk mendapatkan model kalibrasi dengan kemampuan prediksi yang optimum. Adapun kurva hubungan antara nilai kadar terprediksi dan nilai aktual parasetamol, propifenazon, kafein dalam
set kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 10, 11, 12. berikut :
Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) parasetamol dengan metode
spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e
PLS Response Plot
(response is PROPI) 10 components
Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) propifenazon dengan metode
spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e
PLS Response Plot
(response is PCT) 10 components
(62)
2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e
PLS Response Plot
(response is CAFF) 10 components
Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual value) vs kadar terhitung (calculated value) kafein dengan metode spektrofotometri
UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
Tabel VI. Hasil persamaan , R2, dan RMSEC yang didapat dari hubungan antara nilai kadar sebenarnya (actual value) vs nilai terhitung (calculated
value) dengan metode spektrofotometri UV-PLS tanpa cross validation pada
panjang gelombang 220-313 nm
PCT PROPI KAF
Persamaan y = 0,9994x + 0,0034 y = 0,9878x + 0,0426 y = 0,9919x + 0,0101
R2 0,9994 0,9878 0,9919
RMSEC 0,027445698 0,082897315 0,043408954
Dari Tabel VI yang merupakan hasil konsentrasi sebenarnya dan konsentrasi terhitung kemudian diproses menggunakan perangkat lunak
ms.excel 2010 untuk menentukan nilai R2 dan nilai RMSEC.
RMSEC menunjukkan selisih kadar prediksi dengan kadar aktual sehingga jika nilai RMSEC nya semakin kecil maka model – model tersebut dapat dikatakan semakin baik karena faktor kesalahannya semakin kecil (Pindyck and Rubinfeld, 1998).
(63)
Hasil persamaan , R2, dan RMSEC dapat dilihat pada Tabel VI. Nilai RMSEC (root mean square error of calibration) yang diperoleh adalah 0,027 untuk PCT, 0,082 untuk PROPI, dan 0,043 untuk KAF. Nilai RMSEC yang diperoleh sangat baik karena mendekati 0.
C. Validasi model kalibrasi multvariat PLS
Kemampuan prediksi dari model kalibrasi multivariat divalidasi degan dua proses yaitu validasi internal dan validasi eksternal. Validasi internal (cross validation) bertujuan untuk menangani masalah overfitting yang seringkali terjadi dalam proses pembuatan model, sedangkan validasi eksternal bertujuan untuk mengetahui kemampuan prediksi dari keseluruhan model kalibrasi multivariat PLS dengan menetapkan konsentrasi larutan yang telah diketahui.
1. Validasi Silang (cross validation)
Model kalibrasi ketiga senyawa obat (PCT, PROPI, dan KAF) yang dihasilkan mampu memberikan prediksi yang baik dengan nilai koefisien determinasi (R2) parasetamol 0,9994, propifenazon 0,9878, kafein 0,9919. Selanjutnya model kalibrasi ini dilakukan validasi silang (cross validation) dengan menggunakan teknik leave-one out. Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi (misal sampel nomor 1) dikeluarkan, lalu sampel ini dimodelkan dengan sampel yang tersisa. Selanjutnya dihitung nilai terprediksi sampel 1 dari model kalibrasi sampel yang tersisa. Hal ini dilakukan terus–menerus sampai sampel dikeluarkan satu persatu dan
(64)
dimodelkan dengan sampel kalibrasi yang tersisa. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel VII. hubungan antara nilai sebenarnya suatu analit dengan nilai terprediksi yang sudah divalidasi (cross validation) menggunakan teknik
leave-one out dengan metode PLS pada panjang gelombang 220-313 nm.
Tabel VII. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi pls dari sampel yang dilakukan validasi silang (cross validation) yang mengandung
parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), dan kafein (KAF)
Nomor Campuran
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,75522 5,69975 3,65866 3,68038 1,38956 1,37482
2 7,05381 7,01071 2,79465 2,63207 1,35455 1,44016
3 5,20955 5,247 3,45997 3,46215 0,48775 0,51071
4 6,59437 6,58473 4,72492 4,72601 0,58667 0,59199
5 4,01261 4,03477 4,30025 4,33714 0,66383 0,58482
6 6,14643 6,19104 3,59539 3,58442 0,80239 0,80994
7 5,62441 5,62749 4,29166 4,20458 2,08606 2,15583
8 3,89111 3,8241 3,8917 3,76535 0,91807 1,08007
9 6,31005 6,31886 2,16611 2,24273 1,7571 1,70521
10 3,79433 3,79379 2,40636 2,48704 0,96856 0,94366
11 6,99635 7,04102 3,7108 3,94612 1,96758 1,85372
12 6,79089 6,7795 2,83819 2,81941 1,9054 1,90402
13 4,4964 4,49102 4,30366 4,26383 1,44517 1,4633
14 6,43525 6,51072 2,6318 2,68849 0,69071 0,66018
15 4,97807 4,97735 3,5743 3,57149 1,19961 1,19533
16 7,3197 7,33268 3,18242 3,18466 1,62454 1,62625
17 6,06316 5,96793 2,30895 2,21968 0,85277 0,89704
18 6,24785 6,1207 4,63017 4,58746 1,25553 1,28817
19 4,53748 4,54785 3,59021 3,58918 1,19482 1,19348
20 7,24297 7,42754 3,63985 3,86225 1,74932 1,61917
Persamaan y = 1,0125x - 0,071 y = 0,9919x + 0,0358 y = 0,9718x + 0,035
R2 0,997 0,983 0,982
RMSECV 0,0620 0,0954 0,0630
PRESS 0,156 0,782 0,279
Dari hasil diatas dapat dilihat bahwa nilai koefisien determinasi (R2) yang dihasilkan > 0,9 dan nilai RMSECV dan PRESS yang dihasilkan
(65)
rendah (mendekati nol) maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik.
Data dan parameter hasil validasi silang leave one-out parasetamol, propifenazon, dan kafein dapat dilihat pada Gambar 13, 14, 15 :
PLS Regression: PCT versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 9
Analysis of Variance for PCT
Source DF SS MS F P
Regression 9 25,2606 2,80673 1657,48 0,000 Residual Error 10 0,0169 0,00169
Total 19 25,2775
Model Selection and Validation for PCT
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,92489 20,1053 0,204618 23,5800 0,067156 2 0,98766 7,2132 0,714641 9,8431 0,610599 3 0,99980 1,8612 0,926369 2,7101 0,892786 4 0,99995 0,2489 0,990155 0,4887 0,980665 5 0,99996 0,1082 0,995718 0,4678 0,981493 6 0,99999 0,0916 0,996378 0,3407 0,986521 7 0,99999 0,0249 0,999013 0,2802 0,988913 8 1,00000 0,0188 0,999257 0,1578 0,993756 9 1,00000 0,0169 0,999330 0,1566 0,993807 10 0,0151 0,999404 0,1919 0,992410
Gambar 13. Data dan Parameter Hasil Validasi Silang Parasetamol dengan Teknik Leave One- Out
(66)
PLS Regression: PROPI versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 6
Analysis of Variance for PROPI
Source DF SS MS F P
Regression 6 11,1372 1,85620 97,19 0,000 Residual Error 13 0,2483 0,01910
Total 19 11,3855
Model Selection and Validation for PROPI
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,90026 10,8752 0,044816 12,8357 0,000000 2 0,98657 8,4317 0,259437 10,9423 0,038923 3 0,99979 6,7868 0,403906 10,1894 0,105050 4 0,99995 0,8378 0,926414 1,8014 0,841781 5 0,99997 0,4074 0,964222 1,5964 0,859788 6 0,99999 0,2483 0,978193 0,7820 0,931315 7 0,2010 0,982342 1,5140 0,867021 8 0,1676 0,985277 1,9253 0,830901 9 0,1487 0,986944 2,1089 0,814772 10 0,1391 0,987779 2,2584 0,801640
Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang propifenazon dengan teknik leave one-out
PLS Regression: CAFF versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 6
Analysis of Variance for CAFF
Source DF SS MS F P
Regression 6 4,58881 0,764801 123,21 0,000 Residual Error 13 0,08069 0,006207
Total 19 4,66950
Model Selection and Validation for CAFF
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,91806 4,15945 0,109231 4,81996 0,000000 2 0,98819 2,53358 0,457420 3,53777 0,242366 3 0,99979 2,02138 0,567109 3,04110 0,348731 4 0,99995 0,42619 0,908729 0,94181 0,798306 5 0,99997 0,15410 0,966999 0,82296 0,823758 6 0,99999 0,08069 0,982719 0,27957 0,940128 7 0,06369 0,986361 0,41103 0,911976 8 0,04728 0,989875 0,56049 0,879969 9 0,04080 0,991263 0,58235 0,875287 10 0,03800 0,991863 0,58169 0,875428
Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang kafein dengan teknik
(67)
Validasi silang juga dapat menentukan jumlah komponen optimum yang mencirikan data (Ardiyanti, 2014). Berdasarkan hasil validasi silang ini diketahui parasetamol mempunyai 9 komponen, propifenazon mempunyai 6 komponen, dan kafein mempunyai 6 komponen.
Adapun profil hubungan antara kadar prediksi dan kadar aktual parasetamol, propifenazon, kafein dengan validasi silang leave one-out pada Gambar 16, 17, 18 :
7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e Fitted C rossv al Variable
PLS Response Plot (response is PCT)
9 components
Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) hasil validasi silang leave one-out
dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm
(68)
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e Fitted C rossv al Variable
PLS Response Plot (response is PROPI)
6 components
Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) hasil validasi silang leave one-out
dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e Fitted C rossv al Variable
PLS Response Plot (response is CAFF)
6 components
Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual value) vs kadar terhitung (calculated value) hasil validasi silang leave one-out dengan
metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm
Parameter validasi pada analisis multivariat adalah presisi dan akurasi. Presisi dideskripsikan dengan nilai RMSEC (root mean square
(69)
error of calibration), RMSECV (root mean square error of cross validation), , dan PRESS (predicted residual sum of squares), yang mana
semakin kecil nilainya semakin kecil kesalahan prediksi dan semakin baik kemampuan model untuk memprediksi atau semakin baik presisinya. Akurasi dinyatakan dalam koefisien determinasi (R2). Semakin dekat R2 dengan 1 menunjukkan hubungan antara nilai aktual dan nilai prediksi yang semakin baik atau semakin baik presisinya. Selain itu akurasi juga dapat dideskripsikan dengan persamaan y= Bx + A, yang mana x = kadar sebenarnya dan y = kadar terprediksi. Akurasi yang baik jika nilai A mendekati 0 dan B mendekati 1 (Danzer et al, 2004).
RMSECV menggambarkan kemampuan prediksi, nilai RMSECV dapat ditentukan dari nilai PRESS, semakin kecil nilai RMSECV maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik (El-Gindy et al., 2006).
2. Validasi Eksternal
Validasi eksternal dilakukan dengan cara menetapkan konsentrasi 10 larutan validasi dengan hasil yang dapat dilihat pada Tabel VIII. Nilai sebenarnya merupakan nilai yang dibuat pada proses penentuan konsentrasi larutan, sementara itu nilai terhitung merupakan nilai yang diperoleh dari penetapan konsentrasi larutan dengan koefisien model kalibrasi yang telah melewati proses validasi internal.
(70)
Tabel VIII. Evaluasi nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari 10 larutan set validasi yang mengandung parasetamol (PCT), propifenazon
(PROPI), dan kafein (KAF).
No
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,3 5,378 4,4 4,241 2,8 2,942
2 7,7 7,682 3 3,181 2,2 2,33
3 6,2 6,092 2,2 2,01 2,8 2,745
4 4,8 4,712 2,8 2,735 2 1,844
5 7,5 7,442 3,7 3,634 1,1 0,951
6 5,8 5,702 2,5 2,655 1,1 0,939
7 6,7 6,541 2,7 2,804 0,9 1,067
8 7,1 7,011 2,2 2,326 1,2 1,113
9 8,4 8,313 3,1 3,239 1 1,183
10 4,8 4,714 3,3 3,167 1,1 1,12
persamaan y = 0,9946x - 0,0365 y = 0,9196x + 0,2496 y = 1,014x - 0,0194
R2 R² = 0,9975 R² = 0,9564 R² = 0,967
RMSEP 0,0982 0,1454 0,1421
Data yang diperoleh dari Tabel VIII menjelaskan kemampuan prediksi dari model kalibrasi PLS yang diperoleh setelah tahap cross
validation. Kemampuan prediksi yang masih dapat diterima pada validasi
eksternal terlihat dengan nilai R2 yang diperoleh untuk parasetamol 0,9975, untuk propifenazon 0,956, dan untuk kafen 0,967 serta nilai RMSEP parasetamol 0,0982, profipenazon 0,1454, dan kafein 0,1421.
(71)
Tabel IX. rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri UV- PLS
Tahap
Parameter
Validasi PCT PROPI KAFF
Kalibrasi RMSEC 0,027 0,082 0,043
R² 0,9994 0,9878 0,9919
a 0,0034 0,0426 0,0101
b 0,9994 0,9878 0,9919
Validasi Internal RMSECV 0,062 0,095 0,063
cross validation R2 0,997 0,983 0,982
PRESS 0,156 0,782 0,279
a -0,071 0,0358 0,035
b 1,0125 0,9919 0,9718
Validasi
Eksternal RMSEP 0,0982 0,1454 0,1421
R2 0,9975 0,9564 0,967
a -0,0365 0,2496 -0,0194
b 0,9946 0,9196 1,014
Melihat parameter yang dihasilkan dari uji validasi silang dapat dilihat pada Tabel IX. dengan teknik leave one-out dan validasi eksternal yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa model ini masih baik digunakan untuk penetapan kadar sampel sediaan farmasi, karena nilai R2 > 0,9 , RMSEP dan RMSECV-nya kecil.
D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi
Pada penelitian ini yang digunakan sebagai sampel adalah sediaan farmasi dalam bentuk tablet yang mengandung parasetamol, propifenazon, dan kafein. Selanjutnya sediaan ini dibuat dalam konsentrasi yang berada dalam kisaran yang tercakum dalam kurva kalibrasi.
Pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan uji keseragaman bobot agar dapat diketahui tablet mana yang beratnya menyimpang dari
(72)
berat rata-rata tablet. Uji keseragaman bobot tablet dilakukan dengan mengambil sampel tablet sebanyak 20 tablet kemudian dihitung bobot rata– ratanya. Dari hasil penimbangan didapatkan bobot rata–rata 20 tablet adalah 655,635 mg sehingga diketahui bahwa tablet merk S mengandung bahan tambahan kurang lebih 650 mg karena kandungan tablet mengandung parasetamol 250 mg, propifenazon 150 mg, kafein 50 mg, dan sisa dari senyawa aktif adanya bahan tambahan atau bahan pengisi (talk) mengandung 200 mg. Menurut Farmakope Edisi III untuk tablet yang memiliki bobot rata–rata > 500 mg syarat keseragaman bobotnya tidak lebih dari 2 tablet yang masing–masing bobotnya menyimpang dari 5%, dan tidak satu tabletpun bobotnya menyimpang dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1979). Dari hasil penimbangan tidak ada satu pun bobot tablet yang menyimpang dari bobot rata- rata tablet.
Penetapan kadar sampel dilakukan dengan melarutkan sejumlah serbuk yang sudah digerus dan dihomogenkan ke dalam pelarut akuabides lalu diukur menggunakan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-313 nm.
(1)
Lampiran 12. Perhitungan kadar kafein pada sampel tablet menggunakan hasil koefisien validasi silang
Koefisien Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 Sampel 5 Sampel 6
Abs Abs*K Abs Abs*K Abs Abs*K Abs Abs*K Abs Abs*K Abs Abs*K
-0,12 1 -0,12 1 -0,12 1 -0,12 1 -0,12 1 -0,12 1 -0,12
WL253.0 -18,019 0,375 -6,75713 0,385 -6,93732 0,376 -6,77514 0,394 -7,09949 0,377 -6,79316 0,323 -5,82014 WL256.0 13,539 0,347 4,698033 0,356 4,819884 0,348 4,711572 0,363 4,914657 0,348 4,711572 0,298 4,034622 WL259.0 13,672 0,319 4,361368 0,328 4,484416 0,321 4,388712 0,334 4,566448 0,32 4,37504 0,275 3,7598 WL262.0 -4,071 0,293 -1,1928 0,302 -1,22944 0,295 -1,20095 0,306 -1,24573 0,293 -1,1928 0,254 -1,03403 WL271.0 -109,705 0,236 -25,8904 0,244 -26,768 0,238 -26,1098 0,245 -26,8777 0,235 -25,7807 0,205 -22,4895 WL274.0 -18,2 0,219 -3,9858 0,227 -4,1314 0,221 -4,0222 0,227 -4,1314 0,218 -3,9676 0,191 -3,4762 WL277.0 50,08 0,199 9,96592 0,206 10,31648 0,201 10,06608 0,207 10,36656 0,199 9,96592 0,174 8,71392 WL280.0 76,747 0,176 13,50747 0,182 13,96795 0,178 13,66097 0,183 14,0447 0,176 13,50747 0,154 11,81904 WL283.0 66,611 0,148 9,858428 0,153 10,19148 0,149 9,925039 0,154 10,25809 0,148 9,858428 0,129 8,592819 WL286.0 -53,643 0,117 -6,27623 0,121 -6,4908 0,118 -6,32987 0,123 -6,59809 0,118 -6,32987 0,103 -5,52523 WL292.0 54,104 0,06 3,24624 0,061 3,300344 0,061 3,300344 0,064 3,462656 0,061 3,300344 0,054 2,921616 WL295.0 -1,851 0,038 -0,07034 0,038 -0,07034 0,038 -0,07034 0,041 -0,07589 0,039 -0,07219 0,034 -0,06293 WL304.0 -70,661 0,004 -0,28264 0,004 -0,28264 0,005 -0,35331 0,007 -0,49463 0,006 -0,42397 0,005 -0,35331 WL307.0 1,078 0,001 0,001078 0 0 0,001 0,001078 0,003 0,003234 0,003 0,003234 0,003 0,003234
(2)
Lanjutan Lampiran 12.
calculated 1,063 1,051 1,072 0,973 1,042 0,964
penimbangan 130,5 130,2 130,2 130,4 130,5 130,2
pengenceran 10000 10000 10000 10000 10000 10000
bobot rata rata 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635
etiket (mg) 50 50 50 50 50 50
kadar (mg) 53,405 52,924 53,981 48,921 52,35 48,543
(3)
(4)
(5)
(6)
77