Eppendorf kemudian disentrifugasi selama 5 menit, 5000 rpm. Supernatan dibuang dan sisa endapan ditambah dengan Reagen Annexin V Flous dan
diinkubasi selama 10 menit dalam ruangan tanpa cahaya. Reagen annexin berupa campuran dari buffer, reagen annexin dan reagen pi. Setelah
diinkubasi kemudian larutan ditambah buffer 300 µL dan dianalisis CCRC,
2009.
9. Pengamatan ekspresi protein dengan imunositokimia
Sel T47D sejumlah 5 x 10
4
selsumuran ditanam pada coverslip dalam 24 well-plate dengan kondisi 80 konfluen untuk dipanen dan
diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator. Kemudian 24 well-plate diambil dan medium sel dibuang. Well-plate diisi PBS masing-masing 500
µL, lalu buang PBS dicuci PBS. Sampel larutan uji ditambahkan dalam sumuran, dan diinkubasi selama 24 jam. Pada jam ke-24 diambil plate dan
media sel dibuang, lalu dicuci dengan PBS. Coverslip diambil dan diletakkan dalam kaca preparat. Lalu diberi label pada kaca preparat. Metanol dingin 300
µL diteteskan, diinkubasi selama 10 menit. Metanol dibuang secara perlahan. Preparat dicuci menggunakan PBS. Kemudian
ditambah 500 µL aquades, didiamkan 5 menit, dan dibuang dicuci aquades. Selanjutnya preparat
ditetesi larutan hidrogen peroxsidase blocking solution, diinkubasi 10 menit. Lalu larutan dibuang. Selanjutnya ditetesi prediluted blocking serum,
diinkubasi selama 10 menit. Lalu larutan dibuang. Kemudian ditetesi Primer Antibodi Monoklonal anti-
ERα pengenceran 1:100 selama 1 jam dan dicuci
dengan PBS. Kemudian ditetesi biotinylated universal secondary antibody sebanyak 100 µL, diinkubasi 20 menit dan dicuci PBS selama 5 menit.
Reagen kompleks streptavidin-peroxidase ditetesi sebanyak 100 µL dan
diinkubasi selama 10 menit. Lalu dicuci dengan PBS. Larutan DAB 100 µL
diteteskan, lalu diinkubasi selama 2 menit. Kemudian dicuci aquades. Lalu larutan Mayer Haematoxylin
sebanyak 100 µL diteteskan dan diinkubasi 5 menit, kemudian dicuci aquades. Coverslip diangkat dan dicelupkan dalam
etanol absolut. Kemudian dicelupkan dalam xylol, keringkan. Coverslip diletakkan di atas object glass, ditetesi dengan etelen mounting media, cover
slip ditutup dan diamati menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 10-100x Javois, 2007.
F. Tata Cara Analisis Hasil
