D. Alat Penelitian
Gelas beaker, maserator, gelas ukur, rotary evaporator, neraca analitik, treated tissue culture dish diameter 10 cm Iwaki, 96 well-plate
Nune, 24 well-plate Nune, 6 well-plate Nune, cover slip Nune, sentrifuge tube, object-glass, inkubator CO
2
Heracus, mikropipet Gilson, tabung conical Iwaki, sentrifuge, laminar air flow cabinet Labconco,
mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset, autoklaf Hirayama, hemositometer Neubauer, mikroskop inverted Zeiss MC 80, ELISA reader, cell counter,
mikroskop fluoresensi, vortex, eppendorf Plasti brand, kamera digital, mikroskop cahaya.
E. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah simplisia basah daun pukul empat Mirabilis jalapa L. yang diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm
Rasamala A4, Semarang Kota, Jawa Tengah berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur yang dipanen pada bulan Juni 2014.
2. Pengeringan
Tanaman segar yang didapat, dipisahkan dari batang, akar, dan bunga. Kemudian bagian daun dikeringkan untuk mendapatkan simplisia
kering yang akan digunakan dalam penelitian.
3. Pembuatan ekstrak etanol daun pukul empat
Simplisia yang telah disortasi, dibuat serbuk dengan menggunakan blender. Serbuk yang telah halus kemudian diekstrak dengan merendam 10
gram serbuk daun pukul empat dalam 50 mL etanol : air 7:3. Kemudian dilakukan homogenisasi campuran dengan cara pengadukan. Lalu, dimaserasi
selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dimaserasi, kemudian larutan disaring, bagian cair diambil dan dipekatkan menggunakan rotatory
evaporator dengan suhu 80
o
C selama 5 menit dan dilanjutkan dengan penguapan menggunakan waterbath suhu 80
o
C selama 4,5 jam. Hasil diperoleh hingga didapat bobot tetap pada ekstrak dengan konsistensi
semisolid berwarna hijau gelap.
4. Persiapan ekstrak
Ekstrak kental yang telah dibuat ditimbang dan dilarutkan menggunakan DMSO. Kemudian di-vortex agar ekstrak kental dan DMSO
menjadi homogen.
5. Preparasi sel
Semua alat disterilisasi terlebih dahulu. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian dicairkan dalam penangas air pada suhu 37
o
C. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dimasukkan ke dalam LAF. Lalu ampul
dibuka dan sel dipindahkan ke dalam conical tube steril yang berisi media.
Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang. Media yang baru ditambahkan pada endapan sel
kemudian disuspensi perlahan hingga homogen. Sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tissue culture dishflask dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
pada suhu 37
o
C dengan aliran CO
2
5. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian dilakukan penggantian media kultur. Sel ditumbuhkan hingga
konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Setelah sel konfluen, media dibuang dan sel diresuspensi hingga terlepas semua dari dinding dishflask.
Suspensi sel kemudian dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel dihitung dengan haecytometer dan cell counter lalu dibuat suspensi sel
dengan konsentrasi sel sesuai dengan kebutuhan. Jumlah sel dihitung dengan cara :
Doyle and Griffiths, 2000.
6. Preparasi larutan uji
Kategori