Jenis dan Rancangan Penelitian Alat Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

16

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang berjudul “Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanolik Daun Pukul Empat Terhadap Viabilitas, Apoptosis dan Ekspresi Reseptor Estrogen- α Sel Kanker Payudara T47D” termasuk penelitian eksperimental murni acak lengkap pola searah. Penelitian ini termasuk jenis eksperimental karena terdapat perlakuan terhadap subyek uji. Rancangan penelitian acak lengkap pola searah karena penelitian ini memiliki satu faktor dengan banyak level.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel Utama 1 Variabel Bebas : tujuh peringkat konsentrasi ekstrak etanol daun pukul empat Mirabilis jalapa L. yaitu 2.000; 1.000; 100; 10; 1; 0,1; 0,01 µgmL. 2 Variabel Tergantung : viabilitas sel, sel apoptosis, level ekspresi protein ERα. b. Variabel pengacau 1 Variabel pengacau terkendali Lama pengeringan, kondisi sel uji sel T47D. 2 Variabel pengacau tak terkendali Umur tanaman, lama inkubasi dalam uji apoptosis, cuaca, kontaminasi lingkungan.

2. Definisi Operasional

a. Ekstrak etanol daun pukul empat Mirabilis jalapa L. adalah larutan kental hasil ekstraksi total daun pukul empat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi. b. Viabilitas sel adalah data hasil ELISA reader berupa absorbansi Abs tiap sumuran dikonversikan dalam persentase kehidupan sel c. IC 50 adalah nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan pertumbuhan sel sampai 50. d. Uji apoptosis adalah data hasil pengamatan warna warna dapat diatur pada alat menggunakan program cellquest. Sel hidup berfluoresensi hijau, sel apoptosis berwarna pink dan kuning, sel nekrosis berwarna merah. e. Ekspresi protein sel adalah pengamatan ekspresi protein sel yang diamati secara kualitatif dan semikuantitatif. Pengamatan kualitatif dilakukan dengan mengamati warna sel di bawah mikroskop, di mana sel yang berwarna coklat baik pada nukleus dan atau sitoplasma adalah sel yang mengekspresikan ER α dan sel yang berwarna biru tidak. Pengamatan semikuantitatif dilakukan dengan menggunakan level scoring. f. Level ekspresi adalah persentasi populasi sel yang berwarna coklat baik pada nukleus dan atau sitoplasma dalam tiga lapang pandang.

C. Bahan Penelitian

1. Subjek Penelitian

Subjek uji yang digunakan adalah sel kanker payudara T47D, yang diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

2. Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan daun bunga pukul empat Mirabilis jalapa L. yang diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm Rasamala A4, Semarang Kota, Jawa Tengah berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur yang dipanen pada bulan Juni 2014. Bahan untuk kontrol positif adalah tamoxifen Nolvadex. Etanol 70 Merck, DMSO Merck, RPMI, Fungizone 0,5 Gibco, Fetal Bovine Serum FBS 10 vv Gibco, penisilin-streptomisin 1 vv Gibco, tripsin EDTA 0,25, reagen MTT Sigma, reagen stopper, reagen Annexin V Flous Staining Kit Roche, peroxidase blocking solution, Prediluted Blocking Serum, antibodi primer ERα Thermo Fisher Scientific Pierce, biotinylated universal secondary antibody Thermo Lab, streptavidin HRP Lab Vision, peroxidase substrat solution DAB, mayer hematoxylin Dako, alkohol, xylol, aquades.

D. Alat Penelitian

Gelas beaker, maserator, gelas ukur, rotary evaporator, neraca analitik, treated tissue culture dish diameter 10 cm Iwaki, 96 well-plate Nune, 24 well-plate Nune, 6 well-plate Nune, cover slip Nune, sentrifuge tube, object-glass, inkubator CO 2 Heracus, mikropipet Gilson, tabung conical Iwaki, sentrifuge, laminar air flow cabinet Labconco, mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset, autoklaf Hirayama, hemositometer Neubauer, mikroskop inverted Zeiss MC 80, ELISA reader, cell counter, mikroskop fluoresensi, vortex, eppendorf Plasti brand, kamera digital, mikroskop cahaya.

E. Tata Cara Penelitian

1. Pengumpulan bahan

Bahan uji yang digunakan adalah simplisia basah daun pukul empat Mirabilis jalapa L. yang diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm Rasamala A4, Semarang Kota, Jawa Tengah berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur yang dipanen pada bulan Juni 2014.

2. Pengeringan

Tanaman segar yang didapat, dipisahkan dari batang, akar, dan bunga. Kemudian bagian daun dikeringkan untuk mendapatkan simplisia kering yang akan digunakan dalam penelitian.

3. Pembuatan ekstrak etanol daun pukul empat

Simplisia yang telah disortasi, dibuat serbuk dengan menggunakan blender. Serbuk yang telah halus kemudian diekstrak dengan merendam 10 gram serbuk daun pukul empat dalam 50 mL etanol : air 7:3. Kemudian dilakukan homogenisasi campuran dengan cara pengadukan. Lalu, dimaserasi selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dimaserasi, kemudian larutan disaring, bagian cair diambil dan dipekatkan menggunakan rotatory evaporator dengan suhu 80 o C selama 5 menit dan dilanjutkan dengan penguapan menggunakan waterbath suhu 80 o C selama 4,5 jam. Hasil diperoleh hingga didapat bobot tetap pada ekstrak dengan konsistensi semisolid berwarna hijau gelap.

4. Persiapan ekstrak

Ekstrak kental yang telah dibuat ditimbang dan dilarutkan menggunakan DMSO. Kemudian di-vortex agar ekstrak kental dan DMSO menjadi homogen.

5. Preparasi sel

Semua alat disterilisasi terlebih dahulu. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian dicairkan dalam penangas air pada suhu 37 o C. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dimasukkan ke dalam LAF. Lalu ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam conical tube steril yang berisi media. Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang. Media yang baru ditambahkan pada endapan sel kemudian disuspensi perlahan hingga homogen. Sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tissue culture dishflask dan diinkubasi dalam inkubator CO 2 pada suhu 37 o C dengan aliran CO 2 5. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian dilakukan penggantian media kultur. Sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Setelah sel konfluen, media dibuang dan sel diresuspensi hingga terlepas semua dari dinding dishflask. Suspensi sel kemudian dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel dihitung dengan haecytometer dan cell counter lalu dibuat suspensi sel dengan konsentrasi sel sesuai dengan kebutuhan. Jumlah sel dihitung dengan cara : Doyle and Griffiths, 2000.

6. Preparasi larutan uji

Larutan uji dilarutkan dalam DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk dengan konsentrasi 100 .000 µgmL. Larutan induk selanjutnya diencerkan dengan media kultur sehingga diperoleh konsentrasi 2000-0,01 µgmL untuk uji sitotoksik tunggal.

7. Pengamatan viabilitas sel

Sel T47D kepadatan 5 x 10 4 selsumuran diambil dan ditanam pada coverslip dalam 96 well-plate dengan kondisi 80 konfluen untuk dipanen. Kemudian diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang dibalikkan 180 o plate, dikeringkan diatas tisu. Larutan ekstrak etanol daun pukul empat seri konsentrasi sampel, triplo ditambahkan dalam sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang, dicuci PBS 1x. Reagen MTT 100 µL ditambahkan, diinkubasi selama 2-4 jam dalam inkubator sampai terbentuk formazan. SDS 10 dalam 0,1 N HCl 100 µL ditambahkan jika formazan telah terbentuk. Plate dibungkus dengan aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam di tempat gelap tidak dalam inkubator. Kemudian plate dibaca dengan ELISA reader pada λ 595 nm ATCC, 2011.

8. Pengamatan apoptosis

Sel T47D sejumlah 5 x 10 5 2mLsumuran didistribusikan ke dalam 6 well-plate. Kemudian diinkubasi 24 jam, supaya sel beradaptasi. Sel yang telah diinkubasi kemudian dicuci PBS, diberi perlakuan dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media pada tiap sumuran diambil dan dipindahkan pada tiap konical. Conical tube diberi label. Kemudian sumuran pada 6 well-plate diberi PBS, PBS diambil dan dimasukkan pada tiap conical yang sesuai. Pada 6 well-plate diberi tripsin sebanyak 200 µL dan diinkubasi selama 3 menit. Lalu diberi media kultur 1 mL dan ditampung ke conical yang sesuai. Konikal disentrifugasi selama 4 menit, 4000 rpm. Kemudian supernatan dibuang dan sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL, diresuspensi dan dipindahkan ke eppendorf sebanyak 1 mL. Eppendorf kemudian disentrifugasi selama 5 menit, 5000 rpm. Supernatan dibuang dan sisa endapan ditambah dengan Reagen Annexin V Flous dan diinkubasi selama 10 menit dalam ruangan tanpa cahaya. Reagen annexin berupa campuran dari buffer, reagen annexin dan reagen pi. Setelah diinkubasi kemudian larutan ditambah buffer 300 µL dan dianalisis CCRC, 2009.

9. Pengamatan ekspresi protein dengan imunositokimia

Sel T47D sejumlah 5 x 10 4 selsumuran ditanam pada coverslip dalam 24 well-plate dengan kondisi 80 konfluen untuk dipanen dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator. Kemudian 24 well-plate diambil dan medium sel dibuang. Well-plate diisi PBS masing-masing 500 µL, lalu buang PBS dicuci PBS. Sampel larutan uji ditambahkan dalam sumuran, dan diinkubasi selama 24 jam. Pada jam ke-24 diambil plate dan media sel dibuang, lalu dicuci dengan PBS. Coverslip diambil dan diletakkan dalam kaca preparat. Lalu diberi label pada kaca preparat. Metanol dingin 300 µL diteteskan, diinkubasi selama 10 menit. Metanol dibuang secara perlahan. Preparat dicuci menggunakan PBS. Kemudian ditambah 500 µL aquades, didiamkan 5 menit, dan dibuang dicuci aquades. Selanjutnya preparat ditetesi larutan hidrogen peroxsidase blocking solution, diinkubasi 10 menit. Lalu larutan dibuang. Selanjutnya ditetesi prediluted blocking serum, diinkubasi selama 10 menit. Lalu larutan dibuang. Kemudian ditetesi Primer Antibodi Monoklonal anti- ERα pengenceran 1:100 selama 1 jam dan dicuci dengan PBS. Kemudian ditetesi biotinylated universal secondary antibody sebanyak 100 µL, diinkubasi 20 menit dan dicuci PBS selama 5 menit. Reagen kompleks streptavidin-peroxidase ditetesi sebanyak 100 µL dan diinkubasi selama 10 menit. Lalu dicuci dengan PBS. Larutan DAB 100 µL diteteskan, lalu diinkubasi selama 2 menit. Kemudian dicuci aquades. Lalu larutan Mayer Haematoxylin sebanyak 100 µL diteteskan dan diinkubasi 5 menit, kemudian dicuci aquades. Coverslip diangkat dan dicelupkan dalam etanol absolut. Kemudian dicelupkan dalam xylol, keringkan. Coverslip diletakkan di atas object glass, ditetesi dengan etelen mounting media, cover slip ditutup dan diamati menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 10-100x Javois, 2007.

F. Tata Cara Analisis Hasil

a. Analisis nilai IC

50 Data absorbansi tiap sumuran diperlukan untuk memperoleh nilai IC 50 yang kemudian dikonversi kedalam persen viabilitas sel. Persen sel dihitung menggunakan rumus : viabilitas sel = Doyle and Griffiths, 2000. Dibuat regresi linear antara log konsentrasi dengan persen viabilitas sel. Kemudian diproses menggunakan Program R untuk mendapatkan nilai IC 50 .

b. Analisis apoptosis sel

Analisis apoptosis dilakukan dengan metode cellquest dan dibaca menggunakan alat FACS Calibur. Kemudian dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel warna sel yang terlihat merupakan pengaturan yang dapat diubah–ubah. Dalam hal ini, warna hijau menunjukkan sel hidup Annexin - PI - , warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis Annexin + PI - , warna merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis Annexin + PI + Span, 2001 dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis Annexin - PI + Nurzijah et al., 2012. Konversi persentase populasi sel pada setiap kondisi akan diperoleh hasil secara kuantitatif.

c. Analisis ekspresi ER

α Pengamatan kualitatif dilakukan dengan mengamati warna sel di bawah mikroskop, di mana sel yang berwarna coklat mengelilingi sel atau pada inti sel dengan inti biru adalah sel yang mengekspresikan ER- dan sel yang berwarna biru tidak. Pengamatan semikuantitatif dilakukan dengan level scoring Vang et al., 2006. Reaksi diintepretasikan sebagai hasil positif berdasarkan pengecatan. Hasil skor berdasar persentase sel yang menunjukkan ekspresi: negatif ≤ 5 dan positif 5. Pengamatan semikuantitatif ini digunakan untuk tujuan deskripsi, distribusi pengecatan diukur berdasar skor secara semikuantitatif pada persentasi sel positif: 0: ≤ 5; 1+ : 6-25; 2+ : 26-50; 3+ : 51-75; 4+ : 76-100. 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah tanaman pukul empat Mirabilis jalapa L. dan termasuk dalam suku Nyctaginaceae Lampiran 1.

B. Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker payudara T47D

Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui potensi penghambatan pertumbuhan sel akibat perlakuan ekstrak dan menentukan kadar sampel yang dapat menghambat pertumbuhan sel sampai 50 Meiyanto et al., 2008. Uji sitotoksisitas pada penelitian ini dinyatakan dalam parameter IC 50 . Nilai IC 50 merupakan nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan pertumbuhan sel sampai 50. Viabilitas sel dapat dihitung menggunakan beberapa metode pengecatan, dan dapat diukur menggunakan Multiwell Scanning Spectrophotometers ELISA Reader Mossmann, 1983. Pada penelitian ini, pengukuran viabilitas sel menggunakan uji MTT. Secara umum metode pengecatan menggunakan prinsip kolorimetri menggunakan beberapa perubahan warna sebagai titik akhir untuk kuantitasi jumlah sel.