Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang. Media yang baru ditambahkan pada endapan sel
kemudian disuspensi perlahan hingga homogen. Sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tissue culture dishflask dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
pada suhu 37
o
C dengan aliran CO
2
5. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian dilakukan penggantian media kultur. Sel ditumbuhkan hingga
konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Setelah sel konfluen, media dibuang dan sel diresuspensi hingga terlepas semua dari dinding dishflask.
Suspensi sel kemudian dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel dihitung dengan haecytometer dan cell counter lalu dibuat suspensi sel
dengan konsentrasi sel sesuai dengan kebutuhan. Jumlah sel dihitung dengan cara :
Doyle and Griffiths, 2000.
6. Preparasi larutan uji
Larutan uji dilarutkan dalam DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk dengan konsentrasi 100
.000 µgmL. Larutan induk selanjutnya diencerkan dengan media kultur sehingga diperoleh konsentrasi 2000-0,01
µgmL untuk uji sitotoksik tunggal.
7. Pengamatan viabilitas sel
Sel T47D kepadatan 5 x 10
4
selsumuran diambil dan ditanam pada coverslip dalam 96 well-plate dengan kondisi 80 konfluen untuk dipanen.
Kemudian diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang dibalikkan 180
o
plate, dikeringkan diatas tisu. Larutan ekstrak etanol daun pukul empat seri konsentrasi sampel, triplo ditambahkan dalam sumuran
dan diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang, dicuci PBS 1x. Reagen MTT
100 µL ditambahkan, diinkubasi selama 2-4 jam dalam inkubator sampai terbentuk formazan. SDS 10 dalam 0,1 N HCl
100 µL ditambahkan jika formazan telah terbentuk. Plate dibungkus dengan
aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam di tempat gelap tidak dalam inkubator. Kemudian plate dibaca dengan ELISA reader
pada λ 595 nm ATCC, 2011.
8. Pengamatan apoptosis
Sel T47D sejumlah 5 x 10
5
2mLsumuran didistribusikan ke dalam 6 well-plate. Kemudian diinkubasi 24 jam, supaya sel beradaptasi. Sel yang
telah diinkubasi kemudian dicuci PBS, diberi perlakuan dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media pada tiap sumuran
diambil dan dipindahkan pada tiap konical. Conical tube diberi label. Kemudian sumuran pada 6 well-plate diberi PBS, PBS diambil dan
dimasukkan pada tiap conical yang sesuai. Pada 6 well-plate diberi tripsin sebanyak 200 µL dan diinkubasi selama 3 menit. Lalu diberi media kultur 1
mL dan ditampung ke conical yang sesuai. Konikal disentrifugasi selama 4
menit, 4000 rpm. Kemudian supernatan dibuang dan sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL, diresuspensi dan dipindahkan ke eppendorf sebanyak 1 mL.
Eppendorf kemudian disentrifugasi selama 5 menit, 5000 rpm. Supernatan dibuang dan sisa endapan ditambah dengan Reagen Annexin V Flous dan
diinkubasi selama 10 menit dalam ruangan tanpa cahaya. Reagen annexin berupa campuran dari buffer, reagen annexin dan reagen pi. Setelah
diinkubasi kemudian larutan ditambah buffer 300 µL dan dianalisis CCRC,
2009.
9. Pengamatan ekspresi protein dengan imunositokimia
