Model rancangannya adalah : Y
ijk
= µ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ ε
ijk
µ : Nilai rataan umum
α
i :
Pengaruh kultivar tebu ke-i i = 1, 2 βj
: Pengaruh IBA dan IAA pada media induksi perakaran ke-j j = 0.25:0.20 ; 0.25:0.50 ; 0.50:0.20 ; 0.50:0.50
αβ
ij
: Pengaruh interaksi antara kultivar tebu ke-i dengan IBA dan IAA pada media induksi perakaran ke-j
ε
ijk
: Pengaruh galat percobaan kultivar tebu ke-i dan IBA dan IAA pada media induksi perakaran ke-j, ulangan ke-k
Y
ij
: Nilai pengamatan Media optimasi regenerasi yang diperoleh dari regenerasi kalus ini dipakai
pada tahap regenerasi kalus transforman.
3.3.2. Transformasi Kalus Tebu dengan Gen Fitase Santosa et al, 2004 yang
dimodifikasi 3.3.2.1. Penyiapan Kalus untuk Transformasi
Kalus yang embriogenik dipotong dengan ukuran 2-3 mm. Sekitar 20 kalus direndam dalam 15 mL media MScd dan diinkubasi dalam kondisi gelap
28 °C sambil digoyang selama satu minggu pada 60 rpm. Tujuh jam sebelum ko-
kultivasi dengan Agrobacterium, kalus ditambahkan dengan 75 µL antioksidan.
3.3.2.2. Penyiapan A.tumefaciens GV2260 pBIN1-ECS untuk Transformasi
Satu koloni Agrobacterium dari media padat ditumbuhkan pada 5 mL media LB yang mengandung kanamisin 50 mgL dan rifampisin 50 mgL, pada
suhu 28 °C dan digoyang pada 150 rpm, selanjutnya diukur OD
578
= 0.5 lalu dibagi ke dalam 2 mL eppendorf dan disentrifus 2000 x g selama 10 menit. Pelet dicuci
dengan media cair MScd lalu disentrifus lagi dan ditambahkan MScdao kemudian diukur lagi nilai OD
578
= 0.2. Suspensi bakteri siap digunakan untuk transformasi.
3.3.2.3. Transformasi Kalus Tebu dengan Gen Fitase
Kalus tebu dimasukkan kedalam 2 mL eppendorf dan diinokulasi dengan 0.5 mL kultur suspensi Agrobacterium OD
578
= 0.2 dan dibiarkan 5 – 10 menit pada suhu ruang setelah itu kalus dikeringkan dengan kertas steril untuk
mengurangi cairan suspensi bakteri. Kalus yang telah dikeringkan tadi dimasukkan ke dalam 30 mL MS yang mengandung 0.5 gL kasein hidrolisat, 100
mgL asetosiringon dan 50 mgL kanamisin, diinkubasi pada kondisi gelap suhu 28
°C dan digoyang 60 rpm selama 2 hari. Bila ditemukan pertumbuhan Agrobacterium
pada media maka media diganti dengan media baru. Setelah ko- kultivasi kalus dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali, keringkan pada kertas
saring steril, kemudian transfer pada 25 ml MS yang mengandung 0.5 gL kasein hidrolisat, cefotaksim 1000 mgL, inkubasi pada kondisi gelap 28
o
C dan digoyang pada 60 rpm selama 2 jam. Selanjutnya kalus ditransfer ke dalam 30 mL media
MS padat yang mengandung 0.5 mgL kasein hidrolisat, 500 mgL cefotaksim lalu diinkubasi dengan kondisi gelap pada 28
o
C selama 1 minggu, selanjutnya ganti media dengan media MS yang mengandung 0.5 mgL kasein hidrolisat, 500 mgL
cefotaksim, 100 mgL kanamisin dan kultur selama 2 minggu atau lebih untuk memastikan tidak ada pertumbuhan bakteri Ananda, 2004. Selanjutnya kalus
ditanam pada media MS I dengan kanamisin 150 mgL untuk mendapatkan struktur yang kompak dan mampu berproliferasi, setelah sebulan kalus
disubkultur dan selanjutnya dapat diregenerasikan pada media dasar MS dengan zat pengatur tumbuh BAP, Kinetin, IBA dan IAA.
3.3.3. Pengujian Molekuler 3.3.3.1. Ekstraksi DNA
