3.3.3.2. Amplifikasi DNA
Hasil ekstraksi DNA tanaman tebu digunakan untuk amplifikasi DNA dengan teknik PCR. Primer yang digunakan adalah primer spesifik untuk gen
fitase. Primer gen fitase yang digunakan adalah 5’ – CA GGC TCT ATC CGC TAA TCG – 3’ dan 5’ – GG CGC GGT GGG GCA ATA ATC – 3’. Reaksi
diatur sebagai berikut; denaturasi pada 94 C selama 30 detik, annealing pada 58
C selama 30 detik dan ekstension pada 72
C selama 45 detik. Jumlah setiap campuran reaksi sebanyak 25 µL yang terdiri dari 12.5 µL Master Mix; 1.25 µL
masing-masing primer spesifik untuk gen fitase; 1.5 µL DNA tanaman transgenik putatif atau kontrol serta 8.5 µL ddH
2
O. Reaksi dijalankan sebanyak 30 siklus. Selanjutnya DNA hasil amplifikasi dimasukkan dalam sumur gel agarose 2.
Elektroforesis dijalankan selama 45 menit pada 115V dalam buffer 0.5 TAE, kemudian direndam dalam ethidium bromide 10µgmL lalu dilihat pada UV
transsiluminator.
3.3.4. Uji Aktifitas Enzim Fitase Pada Tebu Transforman dan Non Transforman Greiner, 2005
Sebanyak 0.1 g daun tebu transforman dihaluskan menggunakan mortar dan kemudian ditambah 350
μl natrium asetat 0.1 M pH 5.0. Larutan kemudian diinkubasi selama 3 jam pada suhu 4
°C sambil distirer atau dishaker. Setelah itu disentrifugasi pada 1200g selama 15 menit dan didapatkan supernatant sebagai
sumber enzim fitase sebanyak 50 μl. Sumber enzim fitase sebanyak 50 μl
ditambah dengan 350 μl natrium asetat 0.1 M pH 4.5 yang mengandung 1.5 mM
fitat, diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Kemudian untuk menghentikan
reaksi enzim fitase ditambahkan 1500 µl larutan AAM aseton : 5N sulfuric acid : 10 µM ammonium molybdate dengan perbandingan 1 : 1 : 2 pada larutan hasil
inkubasi. Setelah itu 100 µl 1 M asam sitrat ditambahkan sebagai larutan penstabil reaksi enzim fitase tersebut dan ukur OD pada 355 nm.
Aktivitas enzim fitase ini dapat dilihat secara visualisasi yaitu dengan terbentuknya warna agak kekuningan pada larutan sampel bila dibandingkan
dengan larutan blanko. Hal ini disebabkan adanya aktivitas enzim fitase tersebut dalam menguraikan sumber fitat yang ada dalam larutan sampel. Untuk
mengetahui besarnya aktivitas enzim fitase maka setelah diukur kepekatan warna kuningnya OD menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 35 nm
selanjutnya dihitung menggunakan rumus sebagai berikut : U =
ΔE . Volume total ml
Σ.t Volume enzim ΔE = E
sampel
- E
blanko
Σ = 8.7 cm
2
µmol
-1
T = 30 menit ; Volume total = 2000 µl ; Volume enzim = 50 µl Menurut Greiner, 2005, 1 unit aktivitas fitase didefinisikan sebagai jumlah fosfat
yang dapat dibebaskan oleh setiap 1 ml larutan enzim kasar dalam waktu 30 menit pada kondisi suhu 37
C.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4. 1. Kultur Jaringan Tanaman Tebu 4.1.1. Sterilisasi dan Penanaman Eksplan
Eksplan yang ditanam pada media MS yang ditambah 3 mgL 2,4-D dalam kondisi gelap menghasilkan kalus yang kompak, embriogenik, berwarna putih dan
kuning Gambar 2. 2,4-D yang ditambahkan pada media mampu untuk menginduksi kalus pada eksplan tebu dan menghasilkan kalus yang berwarna
putih Chengalrayan dan Meagher, 2001;Mamun et al, 2004.
Gambar 2. A Kalus PA 183 berumur 1 bulan pada media MS I; B Kalus CB 6979 berumur 1 bulan pada media MS I
4.1.2. Regenerasi Tanaman Tebu 4.1.2.1. Regenerasi pada kultivar PA 183
Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa pada pengamatan minggu ke-3 sampai dengan minggu ke-5 penambahan BAP, kinetin dan interaksi antara BAP dan
kinetin berpengaruh nyata terhadap jumlah tunas kalus tebu kultivar PA 183. Media dengan penambahan BAP 0.75 mgL dan kinetin 0.2 mgL merupakan
komposisi media yang menghasilkan jumlah tunas terbanyak.
B A
Kategori