Waktu dan Tempat Isolat Beberapa Mikroba Patogen Isolasi Bakteri Endofit dari Batang dan Akar Tanaman Dara

BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai Agustus 2013 di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan ialah autoklaf, oven, timbangan analitik, cawan petri, labu Erlenmeyer, inkubator, mikroskop, kaca objek, cover glass, gelas ukur, gelas beaker, spatula, tabung reaksi, handspray, propipet, bunsen, jarum ose, cork borer, rak tabung reaksi, pipet serologi, karet penghisap, spektrofotometer, rotary evaporator, sentrifus, tabung sentrifuse, jangka sorong dan mikropipet. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah isolat bakteri endofit dari batang dan akar tanaman obat tapak dara Catharanthus roseus, isolat A. flavus, S. mutans, E. coli, S. thypii, akuades, alkohol 70, alkohol 75, natrium hipoklorit 5,3, zat pewarna Gram, media-media uji biokimia triple sugar iron agar TSIA, simon sitrat agar SCA, sulfid indol motility SIM, starch agar SA, gelatin, H 2 O 2 3, media nutrient agar NA, media potato dextrose agar PDA, agar, cakram kertas kosong, ketokonazol, kloramfenikol, cotton bud, nystatin, media mueller hinton agar MHA, metanol, kertas saring, aluminium foil, dimetilsulfoksida DMSO, larutan kekeruhan 0,5 standar McFarland.

3.3 Isolat Beberapa Mikroba Patogen

Isolat beberapa mikroba A. flavus, S. mutans, S. thypii dan E. coli diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Universitas Sumatera Utara

3.4 Isolasi Bakteri Endofit dari Batang dan Akar Tanaman Dara

Bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman tapak dara terlebih dahulu disterilkan permukaan batang dan akarnya dengan menggunakan metode Radu Kqueen 2002 yang dimodifikasi dapat dilihat pada Lampiran A hlm. 39. Bagian akar dan batang tanaman 3-5 cm dicuci dengan air mengalir selama 20 menit, kemudian akar dan batang tersebut disterilkan bagian permukaannya dengan merendamnya secara berturut-turut dalam larutan etanol 75 selama 2 menit, larutan natrium hipoklorit 5,3 selama 5 menit, dan etanol 75 selama 30 detik. Selanjutnya akar dan batang tersebut dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali, dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Setelah kering, bagian ujung kiri dan kanan dari akar dan batang tanaman dibuang lebih kurang 1 cm, lalu masing-masing dipotong manjadi 2 bagian dan diletakkan pada permukaan media NA yang telah dicampurkan dengan antibiotik ketokonazol 0,3 gram100 ml dengan posisi bekas potongan ke arah media yang kemudian diinkubasi pada suhu ruang 25-30 o C selama lebih kurang 1-3 hari. Koloni yang muncul dari bagian akar dan batang tanaman sebelah dalam disubkulturkan ke media NA yang baru sampai diperoleh biakan murni. 3.5 Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Endofit Identifikasi isolat murni bakteri endofit dilakukan berdasarkan ciri-ciri dan karakter morfologis, secara makroskopis maupun mikroskopis dapat dilihat pada Lampiran B hlm. 40. Karakterisasi dan identifikasi secara visual berdasarkan struktur dan warna koloni. Identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan mengamati morfologinya dengan pewarnaan Gram serta uji biokimia metabolisme bakteri seperti uji sitrat, uji gelatin, uji mortilitas, uji sulfida, uji katalase dan uji hidrolisis pati Lay, 1994.

3.6 Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen