3.4 Isolasi Bakteri Endofit dari Batang dan Akar Tanaman Dara
Bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman tapak dara terlebih dahulu disterilkan permukaan batang dan akarnya dengan menggunakan metode Radu
Kqueen 2002 yang dimodifikasi dapat dilihat pada Lampiran A hlm. 39. Bagian akar dan batang tanaman 3-5 cm dicuci dengan air mengalir selama 20
menit, kemudian akar dan batang tersebut disterilkan bagian permukaannya dengan merendamnya secara berturut-turut dalam larutan etanol 75 selama 2
menit, larutan natrium hipoklorit 5,3 selama 5 menit, dan etanol 75 selama 30 detik. Selanjutnya akar dan batang tersebut dibilas dengan akuades steril sebanyak
2 kali, dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Setelah kering, bagian ujung kiri dan kanan dari akar dan batang tanaman dibuang lebih kurang 1 cm, lalu
masing-masing dipotong manjadi 2 bagian dan diletakkan pada permukaan media NA yang telah dicampurkan dengan antibiotik ketokonazol 0,3 gram100 ml
dengan posisi bekas potongan ke arah media yang kemudian diinkubasi pada suhu ruang 25-30
o
C selama lebih kurang 1-3 hari. Koloni yang muncul dari bagian akar dan batang tanaman sebelah dalam disubkulturkan ke media NA yang baru
sampai diperoleh biakan murni. 3.5 Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Endofit
Identifikasi isolat murni bakteri endofit dilakukan berdasarkan ciri-ciri dan karakter morfologis, secara makroskopis maupun mikroskopis dapat dilihat pada
Lampiran B hlm. 40. Karakterisasi dan identifikasi secara visual berdasarkan struktur dan warna koloni. Identifikasi secara mikroskopis dilakukan dengan
mengamati morfologinya dengan pewarnaan Gram serta uji biokimia metabolisme bakteri seperti uji sitrat, uji gelatin, uji mortilitas, uji sulfida, uji katalase dan uji
hidrolisis pati Lay, 1994.
3.6 Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Bakteri Patogen
Kemampuan bakteri endofit menghambat pertumbuhan bakteri patogen diuji dengan uji antagonis secara in vitro dapat dilihat pada Lampiran C hlm. 41.
Pada media agar MHA dibuat hapusan bakteri patogen dengan OD
600
≈ 0,5 setara 10
8
CFUml yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya
Universitas Sumatera Utara
suspensi bakteri endofit yang telah dibuat dengan kekeruhan yang sama diinokulasikan pada kertas cakram kosong dengan diameter 0,6 cm di bagian tepi
media dengan menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl, dibuat 2 kali pengulangan dan biakan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 1-3 hari. Aktivitas penghambatan ditentukan berdasarkan luas zona hambat yang terbentuk di sekitar
koloni bakteri endofit. Diameter zona hambat tersebut diukur dengan menggunakan jangka sorong. Pengamatan dimulai dari hari pertama sampai hari
kedua Suryanto et al., 2006.
3.7 Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap A. flavus
Kemampuan bakteri endofit menghambat pertumbuhan jamur A. flavus diuji dengan uji antagonis secarain vitro dapat dilihat pada Lampiran D hlm. 42. Pada
jamur patogen, tepi bagian yang aktif tumbuh diambil dengan menggunakan cork borer, diinokulasikan pada media agar MHA tepat di tengah media dan diinkubasi
selama 2-3 hari. Selanjutnya suspensi bakteri endofit yang telah dibuat dengan dengan OD
600
≈ 0,5 setara 10
8
CFUml yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer diinokulasikan pada kertas cakram kosong berdiameter 0,6 cm
sebanyak 10 µl di bagian tepi media, dan dibuat sebanyak 2 kali pengulangan. Biakan diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 1-3 hari. Akitivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk di sekitar koloni. Diameter
zona hambat dihitung dengan mengukur selisih radial pertumbuhan miselium jamur yang terhambat oleh isolat bakteri. Pengamatan dimulai dari hari ke-4
sampai hari ke-5 Suryanto et al., 2006.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.1 Metode pengukuran zona hambat bakteri endofit terhadap koloni
jamur; A. Koloni jamur; B. Zona hambat bakteri endofit terhadap koloni jamur; C. Titik tengah jamur diletakkan; D. Koloni bakteri
endofit; X. Diameter koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya; Y. Diameter koloni jamur normal. hambat yang terbentuk di sekitar
koloni Suryanto et al., 2006.
Pengukuran jari-jari zona hambat bakteri dilakukan dengan menggunakan jangka sorong. Jari-jari zona hambat bakteri endofit
=
Keterangan: Y= Diameter jamur yang tidak terhambat. X= Dimeter jamur yang terhambat
.
3.8 Ekstraksi Bahan Antimikroba dari Bakteri Endofit dengan Pelarut
Kategori