3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sambung Nyawa
Sebanyak 500 gram serbuk simplisia dimasukkan kedalam bejana tertutup, etanol 96 dituangkan ke dalam bejana sampai seluruh simplisia
terendam, diaduk, dibiarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Dipindahkan massa sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-
hati, dituangkan cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, ditutup perkolator,
dibiarkan selama 24 jam. Dibiarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu
terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia. Perkolasi dihentikan setelah tetesan terakhir perkolat tidak berwarna lagi atau apabila sebanyak 500 mg
cairan perkolat diuapkan di atas penangas air tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap vakum putar rotary
evaporator . Kemudian dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer Ditjen
POM, 1995. 3.8 Uji Efek Imunomodulator
Uji efek imunomodulator meliputi penyiapan hewan percobaan, penyiapan kontrol, bahan uji, antigen, uji respon hipersensitivitas tipe lambat,
dan uji titer antibodi.
3.8.1 Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dengan berat 20-35 g dibagi 5 kelompok, 1 kelompok untuk kontrol negatif, 1 kelompok untuk
kontrol positif, dan 3 kelompok uji. Tiap kelompok terdiri dari 6 ekor mencit.
Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu dalam kandang yang baik
pada suhu ruangan untuk penyesuaian lingkungan, pengontrolan kesehatan dan berat badan. Mencit diberi makan pelet hewan dan tetap diberi air minum.
3.8.2 Penyiapan Kontrol, Bahan Uji, dan Antigen
Penyiapan kontrol, bahan uji, dan antigen meliputi penyiapan CMC 1, penyiapan suspensi levamisole, penyiapan suspensi ekstrak daun sambung
nyawa 2, dan penyiapan sel darah merah sapi.
3.8.2.1 Penyiapan CMC Na 1
Pembuatan suspensi CMC Na 1 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1 g CMC Na ditaburkan kedalam lumpang yang berisi air
panas sebanyak 20 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit
air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan air suling sampai batas tanda.
3.8.2.2 Penyiapan Suspensi Levamisole
Pengambilan sampel tablet levamisole yaitu dengan cara ditimbang dan diserbukhaluskan tidak kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah
dihaluskan tersebut kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang 25 mg levamisole Depkes, 1995.
Pembuatan suspensi levamisole dilakukan dengan cara sebagai berikut: ditimbang serbuk levamisole 29,46 mg setara dengan 25 mg levamisole dan
dimasukan kedalam lumpang. Digerus serbuk kemudian ditambahkan suspensi
CMC Na 1 secukupnya. Digerus hingga homogen dan dituangkan kedalam labu tentukur 25 ml, dan kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 1 sampai
batas tanda.
3.8.2.3 Penyiapan Suspensi Ekstrak Daun Sambung Nyawa SEDSN 2
Pembuatan suspensi ekstrak daun sambung nyawa 2 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 500 mg ekstrak daun sambung nyawa
dimasukkan kedalam lumpang, ditambahkan suspensi CMC Na 1 secukupnya kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu
tentukur 25 ml, ditambahkan suspensi CMC Na 1 sampai batas tanda.
3.8.2.4 Penyiapan Sel Darah Merah Sapi SDMS
Penyiapan dan pembuatan SDMS didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Yufri 2011. Darah segar dikumpulkan dari sapi yang
disembelih, diperoleh 500 ml. kemudian ditambahkan 1,5 ml heparin dan dimasukan kedalam termos yang berisi es. Darah dicuci dengan larutan NaCl
fisiologis 1:1 masing-masing sebanyak 5 ml dan diaduk homogen kemudian disentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 15 menit, dibuang
supernatannya, diulangi 3 kali dengan menambahkan 5 ml NaCl fisiologis setiap pengulangan. Setelah didapatkan eritrosit ditambahkan larutan NaCl
fisiologis dengan volume yang sama, hingga diperoleh SDMS 50. Kemudian diambil 0,2 ml SDMS 50, ditambahkan larutan NaCl fisiologis hingga 10 ml,
sehingga diperoleh SDMS 1.
3.8.3 Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat
Efek imunomodulator ekstrak daun sambung nyawa ditentukan dengan mengukur volume respon hipersensitivitas tipe lambat menggunakan uji
pembengkakan telapak kaki hewan uji foot paw swelling test Lakshmi, et al., 2003; Ray, et al., 1996.
Sebanyak 30 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian sebagai berikut:
a. Kelompok I diberi suspensi CMC Na 1 bv sebagai kontrol negatif. b. Kelompok II diberi Suspensi Ekstrak Daun Sambung Nyawa SEDSN
dengan dosis 125 mgkg BB. c. Kelompok III diberi SEDSN dengan dosis 250 mgkg BB.
d. Kelompok IV diberi SEDSN dengan dosis 500 mgkg BB e. Kelompok V diberi Suspensi Levamisole dengan dosis 25 mgkg BB
sebagai kontrol positif. Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi
SDMS 1 dalam dalam larutan NaCl fisiologis secara intraperitoneal pada hari ke-0. Perlakuan dimulai dari hari ke-0 dan diberikan setiap hari selama 7
hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit sebelah kanan diberi tanda batas pengukuran volume kaki mencit. Volume kaki mencit diukur sebagai volume
awal V . Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMS 1
dalam dalam larutan NaCl fisiologis secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan.
Pada hari kedelapan setelah 24 jam diukur volume pembengkakan kaki mencit dengan pletismometer air raksa. Pengukuran dilakukan dengan
mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi air raksa sampai tanda batas pengukuran. Perubahan volume air raksa terlihat pada kenaikan skala
pada pletismometer sebagai volume waktu tertentu Vt kaki mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume
waktu tertentu Vt dengan volume awal V Shivaprasad, 2006.
3.8.4 Uji Titer Antibodi
Kategori