BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah metode penelitian deskriptif. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Kualitatif Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara dan di Laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.1 Bahan-Bahan 3.1.1 Sampel
Sampel yang digunakan adalah sediaan minuman yang terdapat di pasaran di wilayah Kota Medan.
3.1.2 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel didasarkan pada minuman yang pada kemasannya tidak memiliki merek serta tidak mencantumkan nomor izin edar. Metode
pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu metode pengambilan sampel ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel tersebut dapat mewakili sampel
lainnya Sudjana, 2005. Sampel I diperoleh dari Pusat Pasar, Sampel II diperoleh dari Pasar Glugur,
Sampel III diperoleh dari Pasar Sukaramai, Sampel IV diperoleh dari Pasar Beruang dan Sampel V diperoleh dari Pasar Hongkong.
Universitas Sumatera Utara
3.1.3 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini jika dinyatakan lain adalah berkualitas pro analis E. Merck, yaitu Eter, Natrium Hidroksida, Asam
Asetat, Amoniak, Asam Klorida, Etanol, Akuades dan Benang Wool.
3.2 Alat-Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dariSpektrofotometer UV-Visible Hitachi U-2900, neraca analitik Mettler Teledo, bola karet, maat pipet, pipet volume,
tabung reaksi, alat-alat gelas seperti gelas ukur, gelas beaker, batang pengaduk, vial, pinset dan penjepit tabung.
3.3 Pembuatan Pereaksi 3.3.1 Pembuatan larutan asam klorida 0,1 N
Dilarutkan 8,3 ml asam klorida 37
b b
ke dalam 1000 ml akuades Ditjen POM, 1995.
3.3.2 Pembuatan larutan amoniak 10
v v
Dilarutkan 400 ml amoniak25
b b
dalam 1000 ml akuadesDitjen POM, 1995.
3.3.3 Pembuatan larutan natrium hidroksida 1
b v
Dilarutkan 1 g natrium hidroksida kemudian ditambahkan akuades bebas CO
2
sampai 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.4 Pembuatan larutan asam asetat 10
v v
Dilarutkan 10 ml asam asetat glasial dalam 100 ml akuades Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pembuatan larutan uji
Larutan uji dibuat dengan menggunakan metode ekstraksi warna untuk tujuan ekstraksi pemisahan zat warna yang terdapat dalam sampel minuman yaitu:
Digunting benang wool dengan ukuran 15 cm untuk setiap pemakaian masing-masing sampel. Dididihkan dalam akuades kemudian dikeringkan. Dicuci
dengan eter untuk menghilangkan kotoran dan lemak. Kemudian dididihkan dengan NaOH 1 dan dibilas dengan akuades.
Ditambahkan 5 ml asam asetat 10 pada masing-masing 50 ml sampel minuman. Dimasukkan benang wool pada sampel dan dididihkan selama 10 menit,
kemudian diangkat benang wool zat warna dalam sampel minuman akan mewarnai benang wool. Dicuci benang wool dengan akuades, kemudian dimasukkan 50 ml
amoniak dan dididihkan sampai dilihat warna yang berada dalam benang wool luntur atau telah tertarik dalam larutan basa. Larutan basa yang diperoleh
merupakan satu larutan uji dalam berbagai warna kuning yang akan digunakan sebagai cuplikanlarutan uji Sigar, dkk., 2012.
3.4.2 Analisis kualitatif kuning metanil
Pemeriksaan kualitatif kuning metanil pada sampel menggunakan Metode Reaksi Warna dan Spektrofotometri Sinar Tampak.
3.4.2.1 Metode reaksi warna
Dimasukkan 1 tetes larutan uji ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1 ml HCl 0,1 N.
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan 1 tetes larutan baku pembanding kuning metanil ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1 ml HCl 0,1 N akan terbentuk warna ungu
Nath, et al., 2013. Kemudian diamati warna yang terjadi pada sampel dan dibandingkan
dengan warna yang dihasilkan oleh baku pembanding.
3.4.2.2 Spektrofotometri sinar tampak
Prinsip dari metode ini adalah dengan membandingkan kurva absorbansi yang dihasilkan dari sampel dengan baku pembanding yang diukur dengan
spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 400-750 nm.
3.4.3 Analisis kuantitatif kuning metanil Penetapan kadar kuning metanil pada sampel dimulai dengan pembuatan
larutan baku pembanding kuning metanil, penentuan panjang gelombang, penentuan waktu kerja, kurva kalibrasi larutan kuning metanil dan penetapan kadar
kuning metanil pada sampel.
3.4.3.1 Pembuatan larutan induk baku pembanding
Ditimbang dengan seksama 50 mg pewarna kuning metanil BPFI kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, kemudian ditambahkan etanol sampai
garis tanda dan dikocok hingga homogen. Diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm, larutan ini disebut larutan induk baku I LIB I.
Dipipet 2,5 ml larutan induk baku I dengan menggunakan maat pipet dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml kemudian ditambahkan etanol sampai
garis tanda dan dikocok hingga homogen. Diperoleh larutan dengan konsentrasi 50 ppm LIB II.
Universitas Sumatera Utara
3.4.3.2 Penentuan panjang gelombang maksimum
Dipipet 3 ml dari larutan induk baku II dengan menggunakan maat pipet dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu ditambahkan etanol sampai garis
tanda dan dihomogenkan konsentrasi 6 ppm. Diukur serapan maksimum pada panjang gelombang 400-750 nm, dengan menggunakan blanko. Sebagai blanko
digunakan etanol. 3.4.3.3 Penentuan waktu kerja operating time
Dipipet 3 ml dari larutan induk baku II dengan menggunakan maat pipet dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu ditambahkan etanol sampai garis
tanda dan dihomogenkankonsentrasi 6 ppm. Diukur pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh selama 30 menit.
3.4.3.4 Penentuan kurva kalibrasi
Dari larutan induk baku II dipipet sebanyak 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml; 3 ml; dan 3,5 ml dengan menggunakan maat pipet dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 25
ml dan masing-masing ditambahkan etanol sampai garis tanda dan dikocok homogen konsentrasi masing-masing larutan 3 ppm; 4 ppm; 5 ppm; 6 ppm; dan 7
ppm, kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh dan sebagai blanko digunakan etanol akan diperoleh kurva konsentrasi vs
absorban.
3.4.3.5 Penentuan kadar kuning metanil pada sampel
Diekstraksi zat warna kuning metanil dari sampel, prosedur kerjanya sama
dengan pembuatan larutan uji dapat dilihat pada 2.4.1. Masing-masing larutan uji
dipipet 3,5 ml dengan menggunakan maat pipet kemudian dimasukkan masing- masing ke dalam labu ukur 25 ml dan ditambahkan etanol sampai garis tanda dan
Universitas Sumatera Utara
dihomogenkan. Kemudian diukur pada panjang gelombang maksimum 416 nm dan sebagai blanko digunakan etanol. Dilakukan pengulangan sebanyak 6 kali.
Konsentrasi kuning metanil dalam sampel dapat ditentukan berdasarkan persamaan linier kurva kalibrasi y = ax + b, dan kadar kuning metanil dalam sampel
ditentukan dengan menggunakan rumus : Rumus Perhitungan Kadar Kuning Metanil
� =
������� ��
Keterangan : Cs = kadar kuning metanil sesudah pengenceran
mcg ml
V = volume sampel ml Fp = Faktor pengenceran
Bs = Berat sampel g
3.5 Uji Validasi dengan Parameter Akurasi, Presisi, Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan kisaran analit yang akan dianalisis. Uji
validasi yang digunakan yaitu uji akurasi dengan parameter uji perolehan kembali, uji presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi Harmita, 2004.
3.5.1 Penentuan uji perolehan kembali recovery
Uji perolehan kembali dilakukan dengan metode penambahan larutan baku standard addition method. Dalam metode ini, kadar kuning metanil dalam sampel
ditentukan terlebih dahulu, selanjutnya dilakukan penentuan kadar kuning metanil dalam sampel setelah penambahan larutan standar dengan konsentrasi tertentu
Harmita, 2004.
Universitas Sumatera Utara
Uji perolehan kembali dilakukan dengan menambahkan larutan baku kuning metanil berkonsentrasi 50 mcgml sebanyak 1,7 ml ke dalam sampel dan dianalisis
dengan perlakuan yang sama pada sampel. Menurut Harmita 2004, persen perolehan kembali dapat dihitung dengan
rumus di bawah ini: Perolehan Kembali =
C
F
- C
A
�
∗
A ×100
Keterangan: C
F
= Kadar sampel setelah penambahan larutan baku
mcg g
C
A
= Kadar sampel sebelum penambahan larutan baku
mcg g
C
A
= Kadar larutan baku yang ditambahkan
mcg g
3.5.2 Uji ketelitian
Keseksamaan atau presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi merupakan ukuran yang menunjukkan
derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang
memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan Harmita, 2004.
Menurut Harmita 2004, simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus di bawah ini:
RSD = 100
× X
SD
Keterangan :
−
X = Kadar rata-rata sampel
mcg g
SD = Standar Deviasi
mcg g
RSD = Relative Standard Deviation
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Penentuan batas deteksi limit of detection dan batas kuantitasi limit of quantitation
Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi
merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama Harmita, 2004.
Menurut Harmita 2004, batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Simpangan Baku X
SY =
2
2
− −
∑
n Yi
Y
Batas deteksi LOD =
slope X
SY x
3
Batas kuantitasi LOQ =
slope X
SY x
10
3.6 Analisis Data secara Statistik
Menurut Sudjana 2005, kadar kuning metanil yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing larutan sampel dianalisis dengan metode standar
deviasi dengan rumus:
�� = � ∑�� − ��
� − 1 Keterangan :
Xi = Kadar sampel
mcg g
�� = Kadar rata-rata kuning metanil dalam sampel
mcg g
n = Jumlah perlakuan
Universitas Sumatera Utara
Untuk mencari t
hitung
digunakan rumus: �
ℎ�����
= �� − ��
�� √� ⁄
Untuk menentukan kadar kuning metanil di dalam sampel dengan interval kepercayaan 99, α = 0,01, dk = n-1, dapat digunakan rumus:
Kadar kuning metanil μ = X ± tα2, dk x SD √�
Keterangan : X = Kadar rata-rata kuning metanil dalam sampel
mcg g
SD = Standar Deviasi
mcg g
dk = Derajat kebebasan dk = n-1 α = Interval kepercayaan
n = Jumlah perlakuan
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pemeriksaan Kualitatif Kuning Metanil pada Sampel
Pada penelitian ini sebelum dilakukan analisis kuantitatif kuning metanil pada sampel, perlu dilakukan identifikasi untuk mengetahui ada tidaknya kuning
metanil pada sampel dengan menggunakan metode reaksi warna dan metode spektrofotometri sinar tampak pada sampel diperoleh data dan gambar kurva
serapan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.1, Gambar 4.1 dan Gambar 4.2. Identifikasi kuning metanil dengan Metode Reaksi Warna dilakukan dengan
membandingkan warna yang dihasilkan setelah penambahan HCl 0,1 N dari sampel dengan baku pembanding. Selain identifikasi dengan Metode Reaksi Warna juga
digunakan identifikasi dengan Spektrofotometri Sinar Tampak yaitu dengan membandingkan kurva absorbansi pada panjang gelombang 400-750 nm Gandjar
dan Rohman, 2007. Berdasarkan hasil pemeriksaan kualitatif kuning metanil pada sampel
dengan menggunakan Spektrofotometer Sinar Tampak maka diperoleh kurva absorbansi pada panjang gelombang 400-750 nm. Jika sampel mempunyai kurva
absorbansi yang sama dengan kurva absorbansi baku pembanding kuning metanil, maka dapat disimpulkan bahwa sampel positif mengandung kuning metanil.
Universitas Sumatera Utara
Kategori