Studi Penentuan Aktivitas Crude Enzim Papain Dalam Mikrokapsul Ca Alginat-Kitosan

SKRIPSI

MARIA SYLVIA HARLIM NIM : 060802049

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

STUDI PENENTUAN AKTIVITAS CRUDE ENZIM PAPAIN DALAM MIKROKAPSUL Ca ALGINAT-KITOSAN

SKRIPSI

Diajukanuntukmelengkapitugasdanmemenuhisyaratmencapaigelar SarjanaSains

MARIA SYLVIA HARLIM NIM : 060802049

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

PERSETUJUAN

Judul : STUDI PENENTUAN AKTIVITAS CRUDE

ENZIM PAPAIN DALAM MIKROKAPSUL Ca ALGINAT- KITOSAN

Kategori : SKRIPSI

Nama : MARIA SYLVIA HARLIM

NomorIndukMahasiswa : 060802049

Program Studi : SARJANA

Departemen : KIMIA

Fakultas : MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM (FMIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Disetujui di

Medan, Juli 2010 KomisiPembimbing :

PembimbingII PembimbingI

Drs. FirmanSebayang, MS Prof. Dr. JamaranKaban, MSc

NIP. 195607261985031001 NIP. 195106301980021001

Diketahui/DisetujuiOleh :

Departemen Kimia FMIPA USU

Dr. RumondangBulanNst, MS NIP. 195408301985032001

PERNYATAAN

STUDI PENENTUAN AKTIVITAS CRUDE ENZIM PAPAIN DALAM MIKROKAPSUL Ca ALGINAT-KITOSAN

SKRIPSI

Sayamengakuibahwaskripsiiniadalahhasilkaryasendiri,

kecualibeberapakutipandariringkasan yang masing masingdisebutkansumbernya.

Medan, Juli 2010

Maria Sylvia Harlim 060802049

PENGHARGAAN

PujisyukurpenulispanjatkankepadaTuhanYesusKristusatasberkatdankasihNyakepadap enulissehinggapenelitiandanpenyusunanskripsiinidapatdiselesaikan.

Dengan rasa hormat penulis mengucapkan terima kasih kepada bapak Prof.Dr.JamaranKaban,MSc selaku pembimbing I serta Drs. Firman Sebayang,MS selaku pembimbing II yang dengan sabar telah meluangkan waktunya untuk membimbing peneliti dalam melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini hingga selesai.Terima kasih kepada Ibu Dr. Rumondang Bulan,MS dan Bapak Drs. Firman Sebayang,MSselakuKetuadanSekretarisDepartemen Kimia FMIPA - USU Medan.Terimakasihkepada Bu Cut Fatimah Zuhra,SSi,MSiselakudosenwalipeneliti yang telahmeluangkanwaktuuntukmemberikannasehatdan saran kepadapenelitiselamamelakukankuliah di departemen Kimia, FMIPA USU. TerimakasihjugapenulisucapkankepadaBapakDrs.AdilGinting,MScataskesempatan yang diberikankepadapenulisuntukmelakukanpenelitian di laboratorium Kimia Organik, tidaklupajugaterimakasihpenelitiucapkankepadadosen dosen di laboratorium Kimia Organik, Bapak Dr. MimpinGinting,MS, BapakDrs. DarwisSurbakti,MS, IbuJuliatiTarigan,SSi,MSi, IbuHerlinceSihotang,MSi, Ibu Cut

Fatimah Zuhra,SSi,MSi,

IbuHelminaSembiring,SSi,MSisertakepadasemuadosendanstaf di Departemen Kimia

FMIPA USU.

TerimakasihjugapenelitiucapkankepadatemanseperjuanganEkoWibisono yang telahmemberikanbantuandantemandalammengalamiinsidenledakan.

Penelitijugamengucapkanterimakasihkepadaasistenlaboratorium Kimia OrganikbgDaus, kakOcha,SSi, kakDewi,SSi, Robi, Nius, Yem, Merry, Silo, Cristy,

Sam, Sion,Muti,BayudanDeni. Serta

terimakasihkepadalaborandanasistenbiokimiakakSyafia, kakYusma,SSi, Eko,Nurmala, Nora, Agung, Ardi, Egy, Decy, Oki danErvina. TerimakasihjugapenelitiucapkankepadaBapakProf.Dr.SeriBimaSembiring,MScdanbap

akDrs.NimpanBangun,MScataskesedianmemberikan saran

kepadapenelitidankepadaasistenlaboratoriumkimiaanorganikCiCat,SSi, bang Jul, Gullit, Elisa, Karlina, Adel, Lina, SahatdanHamdan. Tidaklupapenelitiucapkanterimakasihkepadasemuaasistenlaboratorium Kimia FarmasiKuantitatif.Kepadateman temanseperjuanganUni, Wid, Frim, Fatma, Joko, Reni, Amy danteman temanseangkatan yang tidakdapatdisebutkansemuanya.Dan

kepadatemanterbaiksayaSuwantoGullit yang

dengansabardanterusmendorongpenulissupayasegeramenyelesaikanpenelitian.Akhirny a, penelitimengucapkanterimakasihsebesar besarnyakepadakedua orang tuasaya papa (Harlim) dan mama (TjhaiPhin) ataskesabarandankasih saying yang diberikandankepadasaudara saudaratersayangsaya Benny Harlim, Theresia Lydia Harlim, Angelina RiniHarlimdan Andreas Andy Harlim yang dengansabarmendorongpenelitiuntuksegeramenyelesaikanpenelitian.

Terimakasihataskasihsayang, motivasidandukungan yang sangatbesaruntukkeberhasilanpeneliti.

ABSTRAK

Telahdilakukanpembuatanmikrokapsulkalsiumalginat

kitosandanstudipenentuanaktivitas crude enzim papain dalamkeadaanbebasdanterenkapsulasidenganmetodeMurachi.Aktivitas optimum crude enzim papain dalamkeadaanbebaspadasuhu 55o_{C dan pH 7 denganwaktuinkubasi 20} menitadalah 92,807 g/ml. Sedangkanaktivitas optimum crude enzim papain dalammikrokapsuldiperolehpadasuhu 60o_{C dan pH 7 dengan lama inkubasi 20} menitadalah 114,983 g/ml. Mikrokapsul crude enzim papain dapatdigunakandelapan kali perulangandenganselangwaktupenyimpanansatuhari. Denganperulangan 8 (delapan) kali, aktivitasmenjadi 29,770 g/ml (aktivitassebesar 26%) padasuhupenyimpanan 25oC danaktivitasmenjadi 32,2 g/ml (aktivitassebesar 28%) padasuhupenyimpanan 10o_C.

ABSTRACT

The formation of microcapsule calcium alginate chitosan has been carried out and a study of activity determination of free papain enzyme and encapsulated papain enzyme is using Murachi method. The optimum activity of free papain at 55o_{C at pH 7}

incubated for 20 minutes is 92,807 g/ml. While the optimum activity of microcapsule crude papain at 60o_{C at pH 7 incubated for 20 minutes is 114,983 g/ml. Crude}

papain microcapsule can be used for eight time with storage interval is one day. After eight time using, activity become 29,770 g/ml (activity is 26%) at 25o_{C storage and}

DAFTAR ISI PERSETUJUAN iii PERNYATAAN iv PENGHARGAAN v ABSTRAK vi ABSTRACT vii

DAFTAR ISI viii

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR TABEL xii

DAFTAR LAMPIRAN xiii

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. LatarBelakang 1

1.2. Permasalahan 3

1.3. PembatasanMasalah 3

1.4. TujuanPenelitian 3

1.5. ManfaatPenelitian 3

1.6. MetodologiPenelitian 3

1.7. LokasiPenelitian 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kitosan 5

2.1.1. Struktur 5

2.1.2. Sifat SifatFisikadan Kimia 6

2.1.2.1. SifatFisika 6

2.1.2.2. Sifat Kimia 6

2.1.3. ModifikasiKitosan 7

2.2. Alginat 8

2.2.1. PembuatanAlginat 9

2.2.2. SifatAlginat 10

2.3. Enzim 13

2.3.1. PenamaandanKlasifikasiEnzim 13

2.3.2. Faktor faktor yang mempengaruhiaktivitasenzim 14

2.3.3. Enzim Papain 15

2.4. ImobilisasiEnzim 16

2.4.1. MetodeImobilisasi 17

2.4.2. Mikroenkapsulasi 19

2.4.3. MikroenkapsulasiAlginat Kitosan 20

BAB 3 BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1. Alat Alat 23

3.2. Bahan Bahan 23

3.3. ProsedurPenelitian 25

3.3.1. PembuatanLarutanPereaksi 25

3.3.1.2. LarutanStandarTirosin 100 mg/L 25

3.3.1.3. Larutan Seri StandarTirosin 25

3.3.1.4. Larutan Buffer Phosphat 25

3.3.1.5. LarutanAlkohol 92% 26

3.3.1.6. Larutan CH3COOH 1% 26

3.3.1.7. LarutanNaOH 0,2 N 26

3.3.1.8. LarutanHCl 1N 26

3.3.1.9. LarutanKasein 1% 26

3.3.1.10. LarutanAsamTrikloroasetat 30% 26

3.3.1.11. LarutanEnzim Papain 1% 26

3.3.1.12. Pereaksi Biuret 27

3.3.2. PembuatanKurvaKalibrasi 27

3.3.2.1. PembuatanKurvaKalibrasiTirosin 27 3.3.2.1.1. Penentuan maksLarutanStandarTirosin 27 3.3.2.1.2. PenentuanKurvaKalibrasiStandarTirosin 27 3.3.2.2. PembuatanKurvaKalibrasi BSA Metode Biuret 27 3.3.2.2.1. Penentuan maksLarutan BSA 27 3.3.2.2.2. PenentuanKurvaKalibrasiLarutan BSA 27 3.3.3. PreparasiSampelGetahPepaya (Carica PapayaL) 28 3.3.4. Isolasi Crude Enzim Papain Dari GetahPepaya 28 3.3.5. Penentuankadar Protein Enzim Papain Metode Biuret 28 3.3.6. PengujianAktivitas Crude Enzim Papain 28 3.3.6.1. PengujianSuhu Optimum Crude Enzim Papain 28 3.3.6.2. Pengujian pH Optimum Crude Enzim Papain 28 3.3.6.3. PengujianAktivitas Crude Enzim Papain 29

3.3.7. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain 29

3.3.8. Penentuan Kadar Enzim Papain yang TidakTerenkapsulasi 29 3.3.9. PengujianAktivitasMikrokapsul Crude Enzim Papain 29

3.3.9.1. PengujianSuhu Optimum Mikrokapsul

Crude Enzim Papain 29

3.3.9.2. Pengujian pH Optimum Mikrokapsul

Crude Enzim Papain 30

3.3.9.3.PengujianAktivitasMikrokapsul

Crude Enzim Papain 30

3.3.10. PengujianStabilitasMikrokapsul Crude Enzim Papain 30 3.3.10.1. PengujianStabilitasMikrokapsul

Crude Enzim Papain PadaSuhu 25o_{C 30} 3.3.10.2.PengujianStabilitasMikrokapsul

Crude Enzim Papain PadaSuhu 10o_{C 31}

3.4. BAGAN PENELITIAN 32

3.4.1. PembuatanKurvaKalibrasi 32

3.4.1.1. PembuatanKurvaKalibrasiTirosin 32 3.4.1.2. PembuatanKurvaKalibrasi BSA Metode Biuret 33 3.4.2. PreparasiSampelGetahPepaya(Carica papayaL ) 34 3.4.3. Isolasi Crude Enzim Papain dariGetahPepaya

(Carica papayaL ) 34

3.4.4. Penentuan Kadar Protein Enzim Papain Metode Biuret 35 3.4.5. PengujianAktivitas Crude Enzim Papain 36

3.4.5.1. PengujianSuhu Optimum Crude Enzim Papain 36 3.4.5.2. Pengujian pH Optimum Crude Enzim Papain 37 3.4.5.3. PengujianAktivitas Crude Enzim Papain 38

3.4.7. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain 39

3.4.7. Penentuan Kadar Enzim Papain Yang TidakTerenkapsulasi 40 3.4.8. PengujianAktivitasMikrokapsul Crude Enzim Papain 41

3.4.8.1. PengujianSuhu Optimum Mikrokapsul

Crude Enzim Papain 41

3.4.8.2. Pengujian pH Optimum Mikrokapsul

Crude Enzim Papain 42

3.4.8.3 PengujianAktivitasMikrokapsul Crude Enzim Papain 43 3.4.9. PengujianStabilitasMikrokapsul Crude Enzim Papain 44

3.4.9.1. PengujianStabilitasMikrokapsul Crude

Enzim Papain PadaSuhu 25o_{C 44}

3.4.9.2. PengujianStabilitasMikrokapsul Crude

Enzim Papain PadaSuhu 10o_{C 45}

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HasilPenelitian 46

4.1.1. Isolasi Crude Enzim Papain dariGetahPepaya 46

4.1.2. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain 46

4.1.3. PenentuanKondisi Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain

danMikrokapsul Crude Enzim Papain 47

4.1.3.1. PenentuanSuhu Optimum 47

4.1.3.2. Penentuan pH Optimum 48

4.1.4. PengukuranStabilitasMikrokapsul Crude Enzim Papain

denganSuhuPenyimpanan 25o_{C dan 10}o_{C 48}

4.2. Pembahasan 49

4.2.1. Isolasi Crude Enzim Papain 49

4.2.2. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain 49

4.2.3. PenentuanKondisi Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain

Dan Mikrokapsul Crude Enzim Papain 51

4.2.3.1. PengaruhSuhu Optimum 52

4.2.3.2. Pengaruh pH Optimum 54

4.2.4. PengukuranStabilitasMikrokapsul Crude Enzim Papain

denganSuhuPenyimpanan25o_{C dan 10}o_{C 54}

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan 56

5.2. Saran 56

DAFTAR PUSTAKA 57

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.StrukturKitosan 5

Gambar 2. D Manuronatdan L Guluronat 10

Gambar 3.Reaksi Ca+2_{danblok G darialginat 11}

Gambar 4.Kalsiumberadapadablok G (egg in an egg box) 12

Gambar 5 MetodeImobilisasi 18

Gambar 6 PembentukanPolielektrolitCaAlginat Kitosan 50

Gambar 7 ReaksiEnzimatisdari Crude Enzim Papain 52

Gambar 8 StrukturTirosin 52

Gambar 9.PengaruhTemperaturPadaAktivitas Crude Enzim Papain dan

Mikrokapsul Crude Enzim Papain 53

Gambar 10Pengaruh pH PadaAktivitas Crude Enzim Papain dan

Mikrokapsul Crude Enzim Papain 54

DAFTAR TABEL

Tabel 1Perbandinganasamuronatdalamberbagaispesies alga 10

Tabel 2 Data Pengukuran Kadar Protein Standar 46

Tabel 3 Aktivitasdari Crude Enzim Papain dan

Mikrokapsul Crude Enzim Papain 47

Tabel 4 Data PengaruhSuhuPadaAktivitas Crude Enzim Papain dan

MikrokapsulCrude Enzim Papain 47

Tabel 5 Data Pengaruh pH PadaAktivitas Crude Enzim Papain dan

MikrokapsulCrudeEnzim Papain 48

Tabel 6 Data PengujianStabilitaspadaPemakaianBerulangdenganSuhu

Penyimpanan 25o_{C dan 10}o_{C 48}

Tabel 7 Data AbsorbansiKurvaKalibrasiTirosin 61

Tabel 8 PenurunanPersamaanGarisregresiMetodeLeast Square

KurvaKalibrasiTirosin 62

Tabel 9 Data AbsorbansiKurvaKalibrasi BSA 63

Tabel 10 PenurunanPersamaanGarisregresiMetodeLeast Square

KurvaKalibrasi BSA (Bovin Serum Albumin) 64

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Data PengukuranTirosin 61

Lampiran 2Pengolahan Data HasilPengukuranTirosin 62 Lampiran 3 Data Pengukuran BSA ( Bovin Serum Albumin ) 63 Lampiran 4Pengolahan Data HasilPengukuran BSA (Bovin Serum Albumin) 64

Lampiran5 DataPerhitungan Kadar Protein 65

Lampiran 6KurvaPenentuanPanjangGelombang

MaksimumLarutan Baku StandarTirosin 66

Lampiran 7Kurva Baku StandarTirosin 67

Lampiran 8Penentuan Operating Time PadaPembuatan

Kurva Baku Standar BSA 68

Lampiran 9KurvaPenentuan maksKurva Baku Standar BSA 69

ABSTRAK

Telahdilakukanpembuatanmikrokapsulkalsiumalginat

kitosandanstudipenentuanaktivitas crude enzim papain dalamkeadaanbebasdanterenkapsulasidenganmetodeMurachi.Aktivitas optimum crude enzim papain dalamkeadaanbebaspadasuhu 55o_{C dan pH 7 denganwaktuinkubasi 20} menitadalah 92,807 g/ml. Sedangkanaktivitas optimum crude enzim papain dalammikrokapsuldiperolehpadasuhu 60o_{C dan pH 7 dengan lama inkubasi 20} menitadalah 114,983 g/ml. Mikrokapsul crude enzim papain dapatdigunakandelapan kali perulangandenganselangwaktupenyimpanansatuhari. Denganperulangan 8 (delapan) kali, aktivitasmenjadi 29,770 g/ml (aktivitassebesar 26%) padasuhupenyimpanan 25oC danaktivitasmenjadi 32,2 g/ml (aktivitassebesar 28%) padasuhupenyimpanan 10o_C.

ABSTRACT

The formation of microcapsule calcium alginate chitosan has been carried out and a study of activity determination of free papain enzyme and encapsulated papain enzyme is using Murachi method. The optimum activity of free papain at 55o_{C at pH 7}

incubated for 20 minutes is 92,807 g/ml. While the optimum activity of microcapsule crude papain at 60o_{C at pH 7 incubated for 20 minutes is 114,983 g/ml. Crude}

papain microcapsule can be used for eight time with storage interval is one day. After eight time using, activity become 29,770 g/ml (activity is 26%) at 25o_{C storage and}

BAB I PENDAHULUAN

1.1 LatarBelakang

Alginatmerupakanpolisakarida linier yang disusunolehresiduasam -D-Manuronatdan -L-Guluronatdandihubungkanmelaluiikatan 1, 4. Alginatberasaldari alga cokelatsejenistumbuhanlaut.Alginattelahdiketahuimerupakanpolisakarida yang tidakbersifattoksis, tidakmenyebabkanalergisertabersifat biodegradable danjugabiokompatibel(Robinson, 1987).

Gel alginatdiperolehmelaluipenggantian ion

natriumdalamnatriumalginatdengankation divalent khususnyakalsium. Gel kalsiumalginatbanyakdimanfaatkandalambidangbiomedissebagaibahanpembuatankaps

ul, butiran,

pembalutluka,dalamindustrimakanansebagaipengentaldansebagaibahankosmetik(Kaba n,2006).

Kitosanmerupakankationikpolimeralam yang diturunkandarideasetilasikitin (Tao et al., 2006).Kitosanmempunyaireaktifitaskimia yang baikkarenamempunyaisejumlahgugushidroksil (OH ) dangugusamin ( NH2) padarantainya (Kumar, 2000).

Komplekspolielektrolitalginatdankitosantelahumumdikembangkandimanabutir an gel alginatdibungkusdengankitosan (Tao et al., 2006).

Gaserod (1998) telahmenelitipembuatanmikrokapsulalginat kitosandenganmeneteskanlarutannatriumalginatkedalamlarutankitosanataudenganmen ginkubasibutirankalsiumalginatdalamlarutankitosan.

Wen tao (2005) telahmenelitioptimisasikultur Saccharomyces cerevisiaedalammikrokapsulalginat kitosan.

Penggunaankitosanyaituuntukmeningkatkanketahananmekanisdanstabilitasdari mikrokapsuldikarenakanterbentukinteraksipolikationkitosandenganpolianiongel alginat(Baruch andMarcelle, 2006).

Enzimadalahgolongan protein yang paling banyakterdapatdalamselhidup, danmempunyaifungsipentingsebagaikatalisator(Wirahadikusumah, 1989).

Enzimproteolitikmerupakansalahsatubagian yang paling pentingdalamgrupenzimkomersial.Enziminimempunyaibanyakkegunaandalam proses industri, sepertiindustrideterjen, industrimakanandanindustrikain(Kumar dan Takagi,1999).

Enzimproteolitikbanyakdigunakandalamisolasiseldikarenakankemampuannyau ntukmengdegradasikomponenekstraselularmatriks(Grabovac et al., 2007).

Papain adalahsuatuenzim yang dapatdiperolehdarigetahtanamanpepaya. Papain cukupbanyakmengandungberbagaimacamenzim yang bersifatproteolitik (pengurai protein) (Warisno,2003).

Masalahdalampenggunaanenzimyaitudimanaenzimmudahlarutdalam air sehinggasulituntukdiambilkembali.Namun,

enzimdapatdiimobilisasisehinggamemberikeuntungandimanaenzimdapatdiambilkemb alisehinggadapatdigunakandalamjangkawaktu yang lama (www.rsc.org).

Penjebakanmerupakansalahsatumetodeimobilisasimikroorganisme yang banyakdigunakandalambidangindustri,bioteknologi, kedokteran, danpertanian (Liouniet al., 2008).

Sebayang (2006) telahmengimobilisasienzim papain denganmetodepenjebakan (entrapment) menggunakanalginatsebagaimatrikspolimer.

Killing (2002) telahmengimoblisasi papain dengankitosandenganmetodeadsorpsidanpengikatansilangdenganglutaraldehid.Namun enzimterimobilisasitersebutmenunjukkannilaiaktivitasspesifik yang rendah.

Cahyaningrum (2007) telahmengimobilisasi papain padakitosandarilimbahudangdenganmetodeadsorpsidanmetode carrier croslinkingmenggunakankation magnesium sebagaiagenbifungsionaldimana papain imobilmampudigunakansecaraberulangsebanyak 6 kali.

Berdasarkanhaltesebut, penelitiinginmengimobilisasienzim papain

dalammikrokapsulCaAlginat-Kitosansertamengujistabilitasnyasupayadapatdigunakanpadaindustri. 1.2 Pemasalahan

1. Berapakahaktivitas crude enzim papain bebasdan crude enzim papain yang dienkapsulasidenganCaAlginat Kitosanpada pH dan temperatur optimum

2. Apakahmikrokapsul crude enzim papain

dapatdigunakansecaraberulangpadatemperaturpenyimpanan 25o_{C dan 10}o_C sertaberapakahperbedaanaktivitas yang terjadi

1.3 PembatasanMasalah

Penelitianhanyadilakukanpadamikroenkapsulasi crude enzim papain dalammikrokapsulCaAlginat

Kitosandandilakukanpengujianstabilitasdenganvariasipenyimpananpadatemperatur25o C sertasuhu 10o_C.

1.4 TujuanPenelitian

1. Untukmengetahuiaktivitas crude enzim papain bebasdan crude enzim papain yang dienkapsulasidenganCaAlginat Kitosanpada pH dantemperatur optimum

2. Untukmengetahuistabilitas crude enzim papain yang dienkapsulasidenganCaAlginat Kitosanpadatemparaturpenyimpanan 25o_{C dan} 10o_{C sertaperbedaanaktivitas yang terjadi}

1.5 ManfaatPenelitian

Penelitianinidiharapkandapatmemberikansumbanganbagipemanfaatanenzim papain dalambidangindustrisertadapatmemberikansumbanganpengembangandalampemanfaat anpolimeralam, khususnya Na Alginatdankitosan.

1.6 MetodologiPenelitian

Metodologipenelitian yang dilakukanadalah :

Dilakukanisolasi crude enzim papain darigetahbuahpepayadenganmetode Balls danLineweaveryang selanjutnyaimobilisasi crude enzim papaindenganmetodepenjebakandalambentukmikrokapsuldenganmenggunakanCaAlgi natdankitosansebagaimatrikspembungkusnya.Pengujianaktivitasdari crude enzim

papain danmikrokapsul crude enzim papain

dilakukandenganmetodeMurachiyaitudenganmenvariasikantemperaturdan pH sertadilakukanpengujianstabilitasdaripemakaianmikrokapsul crude enzim papain secaraberulang yang disimpanpadatemperatur 25o_{C dan 10}o_{C.Sedangkanpengujiansisa} crude enzim papain yang tidakterkapsulkanditentukandenganmetode biuret.

1.7 LokasiPenelitian

Penelitianinidilakukan di laboratoriumKimia Organik Proses FMIPA-USU Medan danlaboratoriumBiokimia FMIPA-USU Medan danpengukurandilakukan di laboratorium Kimia FarmasiKuantitatifFakultasFarmasi-USU

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kitosan

Kitosan adalah poli (2 amino 2- deoksi (1 4 ) D glukopiranosa) dengan rumus molekul (C6H11NO4)n yang dapat diperoleh dari deasetilasi kitin. Kitosan juga dijumpai secara alamiah di beberapa organisme. Proses deasetilasi kitosan dapat dilakukan dengan cara kimiawi maupun enzimatik. Proses kimiawi menggunakan basa, misalnya NaOH, dan dapat menghasilkan kitosan dengan derajat deasetilasi yang tinggi, yaitu mencapai 85 93% (Sugitadkk., 2009).

2.1.1. Struktur

Kitosan adalah suatu rantai linear dari D Glukosamin dan N Asetil D Glukosamin yang terangkai pada posisi (1-4 ).(Adriana et al, 2003). Kitosan adalah suatu kitin N deasetilasi yaitu biomaterial yang mempunyai sifat biologi yang efektif seperti aktivitas bakteri (Sashiwa, 2003) , biodegradable, biokompatibel, dan tidak beracun (Kaban, 2006).

Kitosan juga terdapat secara alami dalam beberapa jamur namun tidak sebanyak kitin. Struktur idealnya dapat dilihat dari gambar 1 :

Karena adanya gugus amino, kitosan merupakan polielektrolit kationik (pKa 6,5) hal yang sangat jarang terjadi secara alami. Sifat yang basa ini menjadikan kitosan :

a. Dapat larut dalam media asam encer membentuk larutan yang kental sehingga dapat digunakan dalam pembuatan gel. Dalam beberapa variasi konfigurasi seperti butiran, membrane, pelapis kapsul, serat dan spons.

b. Membentuk kompleks yang tidak larut dengan air dengan polianion yang dapat juga digunakan untuk pembuatan butiran gel, kapsul, dan membran.

c. Dapat digunakan sebagai pengkhelat ion logam berat dimana gelnya menyediakan sistem produksi terhadap efek dekstruksi dari ion (Meriaty,2002).

2.1.2. Sifat Sifat Fisika dan Kimia 2.1.2.1. Sifat Fisika

Kitosan adalah padatan amorf putih yang tidak larut dalam alkali dan asam mineral kecuali pada keadaan tertentu.Kitosan merupakan molekul polimer yang mempunyai berat molekul tinggi.Kitosan dengan berat molekul yang tinggi didapati dengan mempunyai viskositas yang baik dalam suasana asam.Kitosan hasil deasetilasi kitin larut dalam asam encer seperti asam asetat, asam formiat, dll.Kitosan dapat membentuk gel dalam n metilmorpin n oksida yang dapat digunakan dalam formulasi pelepasan obat terkendali. Kandungan nitrogen dalam kitin berkisar 5 8% tergantung pada tingkat deasetilasi sedangkan nitrogen pada kitosan kebanyakan dalam bentuk gugus amino. Maka kitosan bereaksi melalui gugus amino dalam pembentukan N asilasi dan reaksi Schiff yang merupakan reaksi yang penting (Kumar, 2000).

2.1.2.2 Sifat Kimia

Adanya gugus amino dan hidroksil dari kitosan juga menyebabkan kitosan mudah dimodifikasi secara kimia antara lain dalam reaksi pembentukan :

a. N Asil

Metode yang paling sederhana adalah dengan mereaksikan asam karboksilat dengan kitosan. Pemanasan larutan kitosan dalam asam formiat 100% pada suhu 90oC dengan penambahan piridin sedikit demi sedikit untuk

menghasilkan N formilatosan serta N Asetil dalam asetat 20%. Pereaksi yang paling banyak digunakan untuk N Asilasi kitosan adalah asil anhidrida, baik dalam kondisi homogen dan heterogen

b. O Asilasi

Gugus amino kitosan lebih reaktif daripada gugus hidroksilnya. Gugus amino perlu diproteksi selama proses asilasi untuk menghasilkan O asil Kitosan. Metode proteksi yang dilakukan antara lain melalui pembuatan basa Schiff disusul O Asetilasi menggunakan larutan untuk mencegah hidrolisis asam dan basa Schiff.Pembuatan O Asetil Kitosan dapat juga dilakukan dengan melarutkan kitosan terasetilasi dalam asam formiat 90% yang mengandung asetat anhidrida dengan HClO4 dengan asumsi protonasi akan mencegah terjadinya N Asetilasi.

N dan O Asetilasi kitosan juga dapat diperoleh bersamaan dengan menggunakan asil klorida. Caranya dengan merefluks kitosan dalam dodekanoil klorida berlebih piridin kloroform dan ditambah asam klorida sesudah direfluks 5 jam. Produk yang diperoleh sesudah 9 jam larut dalam kloroform, benzene, dietil eter, dan piridin.

c. Eter Kitosan

Pembuatan turunan O alkil kitosan dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu O Alkilsi kitin disusul pengurangan N Asetilasi dan O Alkilasi derivatif kitosan dimana gugus amino diproteksi selama reaksi alkilasi.

Karboksimetil kitosan yang dipeorleh melalui prosedur pertama menghasilkan garam natrium dengan gugus amin bebas dalam bentuk busa ataupun garam hidroklorida dari asam amino dengan gugus karboksimetil dalam bentuk asam.Sensitifitas terhadap penambahan elektrolit meningkat dengan bertambahnya karboksimetilasi.Perlakuan alkali kitin dengan epiloklorohidrin pada 0 15o_{C disusul deasetilasi menghasilkan O hidroksialkil kitosan} (Kaban, 2007).

Kitosan dalam bentuk terprotonasi menunjukkan kerapatan muatan yang tinggi dan bersifat sebagai polielektrolit kationik dan sangat efektif berinteraksi dengan biomolekul bermuatan negatif molekul permukaan (Sugita dkk., 2009).

2.1.3. Modifikasi Kitosan

Kitosan dapat dimodifikasi menjadi berbagai bentuk seperti serpih, hidrogel, membran dan butiran. Perbedaan bentuk kitosan akan mempengaruhi pada luas permukaannya. Semakin kecil ukuran kitosan, maka luas permukaan kitosan akan semakin besar.

a. kitosan berbentuk serpihan

Afinitas kitosan bentuk serpihan telah diuji coba terhadap ion Pb+2_{, Ni}+2_{, dan} Cr+2_{dan persentase pengikatan adalah 84 98, 40 92, dan 17 46% berturut}

turut.

b. hidrogel kitosan

Pelarutan kitosan dalam asam asetat merupakan cara sederhana untuk membentuk hidrogel kitosan. Hidrogel kitosan yang dibentuk oleh penambahan bahan senyawa penaut silang disebut hidrogel kitosan kovalen atau ionik. Penaut silang yang digunakan merupakan molekul berbobot molekul lebih rendah daripada bobot molekul kedua rantai polimer yang akan ditautkan.

c. kitosan berbentuk membran

Membran dapat disiapkan dengan menggunakan beberapa metode antara lain pelelehan, pengepresan, track etching, dan pembalikan fase. Pembalikan fase adalah proses yang mengubah polimer dari bentuk larutan menjadi bentuk padatan secara terkontrol. Asnel (2008) membuat membran gel kitosan alginat dengan penaut silang glutaraldehida.

d. kitosan berbentuk butiran

Kitosan dapat dibuat menjadi bentuk butiran dengan pelarutan 3 gram kitosan dalam 100 ml larutan asam asetat 1% yang diteteskan pada larutan NaOH 4% maka diperoleh butiran berbentuk bola. Kitosan berbentuk butiran yang terbentuk dikumpulkan dan dicuci dengan akuades. Shentu, et al telah membuat kitosan dalam bentuk butiran yang digunakan untuk proses adsorpsi enzim catalase (Sugita dkk., 2009).

2.2. Alginat

Alginat adalah polisakarida anionik berasal dari rumput laut coklat yang bersifat biokompatibel dan biodegradable dimana terdiri dari D Manuronat dan L Guluronat yang dihubungkan dengan ikatan (1 4) dengan berbagai perbandingan

G / M. Alginat yang tersedia secara komersial adalah dalam bentuk garamnya yaitu natrium alginat (Wang et al., 2006)

Asam alginat diperoleh dari Rhodophyceae alga cokelat yang merupakan tumbuhan laut.Dihasilkan di Amerika Serikat dan pada umumnya dalam jenis Macrocytis Pirefera, tumbuhan laut yang besar (Robinson, 1987).Alga umumnya diekstraksi dengan alkali dan biasanya diendapkan dari ekstraknya dengan asam ataupun garam kalsium (Caserio, 1977).

2.2.1. Pembuatan Alginat

Asam alginat terdapat sebagai garam garam kalsium, magnesium, dan natrium.Tahap pertama pembuatan alginat adalah dengan mengubah kalsium dan magnesium alginat yang tidak larut menjadi natrium alginat yang larut dengan pertukaran ion dibawah kondisi alkali.

Proses pertukaran ion alginat dilakukan dengan mineral asam sebelum diekstraksi dengan alkali.

Larutan natrium alginat kasar yang diperoleh di filtrasi dan diendapkan dengan Ca+2 untuk membentuk garam kalsium yang tidak larut. Selanjutnya pemisahan dilakukan dengan proses asidifikasi untuk memisahkan asam alginat dan ion ion kalsium.

Kemudian gel asam alginat, setelah didehidrasi dicampurkan dengan alkali (Na2CO3) untuk membuat kembali garam natrium yang larut.

Akhirnya diperoleh pasta natrium alginat lalu dikeringkan dan digiling untuk memperoleh bubuk natrium alginat (Zhanjiang,1990).

Setiap produksi dari tanaman ini menghasilkan jenis jenis alginat yang berbeda beda dimana jumlahnya tergantung pada masa panennya dan bagian anatomi dari tumbuhan itu sendiri, dan dapat dilihat dari tabel dibawah ini :

Tabel 1. Perbandingan asam uronat dalam berbagai spesies alga

Nama Spesies Perbandingan Asam Uronat(%)

Asam Guluronat (G) Asam Manuronat (M)

Ascophyllum nodosum 35 65

Macrocytis pyrifera 40 60

Laminaria hyperborean 70 30

Perbandingan yang bervariasi dari ketiga segmen menyebabkan perbedaan sifat produk yang dihasilkan. Alginat yang mengandung asam guluronat yang tinggi akan cenderung mempunyai struktur yang kaku (rigid) serta mempunyai porositas yang besar, sedangkan yang mengandung asam manuronat yang tinggi mempunyai struktur yang tidak kaku (Prakash,S.,dkk,2004).

2.2.2. Sifat Alginat

Alginat yang banyak tersedia biasanya dalam bentuk garam yaitu natrium alginat. Keunikan dari natrium alginat yaitu perubahannya menjadi hidrogel dengan 95% molekul air di dalamnya, yang merupakan syarat penting untuk penggunaan dalam menjebak senyawa(Wang et al., 2006)

Gambar 3 Reaksi Ca+2_{dan blok G dari alginat}

Ketika natrium alginat bertemu dengan kation divalent seperti Ca+2 menghasilkan pembentukan gel dimana residue G dari alginat yang mengikat ion Ca+2 (Wang et al., 2006). Diduga adanya ikatan kompleks terbentuk antara satu Ca+2 _dan dua blok GG dalam struktur kotak telur yaitu 5 COO- _{dan 2-OH dari unit G dalam} pembentukan ikatan (Wang et al.,2006)

Ion kalsium dapat berkoordinasi dengan gugus karboksil dan atom oksigen pada cincin dari tiap blok paralel. Gel alginat membentuk jaringan tiga dimensi molekul rantai panjang yang terdiri dari ikatan dari daerah blok G molekul alginat dengan ion kalsium (Zhanjiang,1990). Ketika blok G tersusun paralel berbentuk pola rantai seperti dengan lubang lubang yang sangat ideal sebagai tempat pengikatan kalsium ini menyerupai telur dalam kotaknya (egg in an egg box) dan dapat dilihat sebagai berikut :

Gambar 4. Kalsium berada pada blok G (egg in an egg box)

Reaktivitas kalsium terhadap alginat adalah hasil penggabungan dimer dari daerah blok G yang diinduksi oleh kalsium. Penggabungan antar rantai dapat bersifat sementara atau permanen bergantung pada jumlah kalsium yang ada pada sistem. Dengan kadar kalsium yang rendah akan dihasilkan penggabungan sementara, menghasilkan larutan yang sangat kental. Jika kadar kalsium tinggi, akan terjadi pengendapan atau gelasi dari penggabungan permanen dari rantai. (ISP,2003)

Gel terbentuk melalui reaksi kimia dimana kalsium menggantikan natrium dengan alginat mengikat molekul molekul alginat yang panjang sehinggga membentuk gel. Tergantung dari jumlah kalsium yang memberikan asosiasi sementara dan meningkatkan viskositas larutan, sementara kandungan kalsium yang tinggi menghasilkan assosiasi permanen yang menyebabkan pengendapan atau gelatin. Gel yang lebih homogen dan stabil dapat diperoleh melalui pendinginan yang lambat larutan alginat dengan adanya ion kalsium. Gel yang dibentuk selama pendinginan

secara kimia lebih mudah dikontrol dan tidak mudah meleleh bila dipanaskan walaupun terdegradasi dan pada pH yang ekstrim (Robinson, 1987).

Kegunaan dari alginat didasarkan pada 3 sifat utamanya adalah :

a. Kemampuan untuk larut dalam air serta meningkatkan viskositas larutan b. Kemampuannya untuk membentuk gel

c. Kemampuannya untuk membuat film (natrium alginat) dan serat (kalsium alginat)

Dalam industri tekstil, alginat digunakan sebagai pengental pasta yang mengandung zat pewarna. Bahan pengental lain seperti pati sering digunakan tetapi bereaksi dengan bahan pengaktif pewarna, sehingga menghasilkan warna yang lebih rendah dan kadang kadang limbahnya sulit untuk dicuci. Alginat tidak bereaksi dengan zat pewarna dan dengan mudah dicuci dari tekstil sehingga alginat menjadi pengental yang terbaik untuk zat pewarna (Mchugh, 2003).

Alginat dapat digunakan untuk memperbaiki struktur dasar kitosan. Interaksi kitosan dengan alginat menghasilkan pembentukan kompleks polielektrolit menurut persamaan reaksi berikut :

~COO-_Na+ _{+ Cl}- +_NH

3~ ~COO-NH3~ + NaCl(Sugita dkk., 2009). 2.3. Enzim

Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel makhluk hidup dan mempunyai fungsi yang penting sebagai katalisator reaksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolism perantara dari sel (Wirahadikusumah, 1989).

Karakteristik penting suatu enzim adalah spesifitas substrat, sebagian besar enzim akan bereaksi terhadap suatu bahan atau kelompok bahan tertentu. Tetapi beberapa enzim lain bersifat hampir absolut spesifik untuk satu substrat saja. Enzim dinamai menurut reaksi terhadap zat atau bahan spesifik yang dikatalisis (Yudoamijoyo,1992).

Enzim adalah biokatalis alami.Senyawaan yang dimana enzim bekerja disebut sebagai substrat.Enzim mempunyai spesifitas yang cukup sempit dimana enzim hanya dapat digunakan pada beberapa substrat spesifik saja. Enzim dapat ditemukan pada letak yang berbeda dalam sel. Enzim dapat menjadi bagian dari membran sel, enzim dapat muncul pada sitoplasma, nukleus atau organel lainnya dalam sel. Enzim pada

umumnya dapat diisolasi dan dimurnikan terkadang ditingkatkan aktivitasnya (Jhonson, 1978).

2.3.1. Penamaan dan Klasifikasi Enzim

Kebanyakan enzim diberi nama dengan menambahkan akhiran ase pada kata yang menunjukkan senyawa asal yang diubah oleh enzim atau pada nama jenis reaksi kimia yang dikatalisis enzim.

Hidrolase mengkatalisis reaksi hidrolisis. Sebagai contoh: Kabohidrase memecah karbohidrat

Lipase memecah lemak (lipida)

Protease memecah protein (Gaman, 1992).

Klasifikasi enzim secara internasional meliputi golongan, nomor kode, dan macam reaksi yang dikatalisisnya dan tiap golongan utama terbagi lagi menjadi kelompok kelompok enzim berdasarkan gugus substrat yang diserangnya :

1. Oksido reduktase : berperan dalam reaksi oksidasi reduksi 2. Transferase : berperan dalam reaksi pemindahan gugus tertentu 3. Hidrolase : berperan dalam reaksi hidrolisis

4. Liase : mengkatalisis reaksi adisi atau pemecahan ikatan rangkap dua 5. Isomerase : mengkatalisis reaksi isomerisasi

6. Ligase : mengkatalisis reaksi pembentukan ikatan dengan bantuan pemecahan ikatan dalam ATP (Wirahadikusumah, 1989).

2.3.2. Faktor faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim 1. Pengaruh Suhu

Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu.Pada suhu di atas dan di bawah optimalnya, aktivitas enzim berkurang.Di atas suhu 50o_{C enzim secara bertahap} menjadi inaktif karena protein terdenaturasi.Pada suhu yang sangat rendah, enzim tidak benar benar rusak tetapi aktivitasnya sangat banyak berkurang.

2. Pengaruh pH

Masing masing reaksi yang dikatalisis oleh enzim paling cepat terjadi pada pH yang tertentu.Untuk kebanyakan enzim pH optimal adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim menjadi

inaktivasi.Akan tetapi beberapa enzim hanya beroperasi dalam keadaan asam atau alkalis.

3. Pengaruh ko enzim dan aktivator

Enzim sering kali memerlukan bantuan substansi lain agar berfungsi secara efektif. Ko enzim adalah substansi bukan protein yang mengaktifkan enzim. Beberapa vitamin B berfungsi sebagai ko enzim. Beberapa ion anorganik, misalnya ion kalsium dan ion klorida, menaikkan aktivitas beberapa enzim dan dikenal sebagai activator (Gaman, 1992).

Penentuan aktivitas enzim biasanya dilakukan pada pH optimum dan dengan konsentrasi substrat yang berlebih. Pengamatan reaksi biasanya ditentukan dengan penentuan terbentuknya hasil reaksi dengan berbagai cara kimia atau spektrofotometri. Cara yang terakhir ini lebih baik , karena dapat dilakukan secara kontinu dan dapat dicatat dalam suatu bagan (Wirahadikusumah, 1989).

2.3.3. Enzim Papain

Papain adalah suatu enzim yang dapat diperoleh dari getah tanaman pepaya dan buah pepaya muda.Getah tersebut terdapat di hampir semua bagian tanaman pepaya, kecuali bagian akar dan biji.Kandungan papain paling banyak terdapat dalam buah pepaya yang masih muda.

Dalam dunia perdagangan, dikenal dua macam papain yaitu papain kasar (crude papain) dan papain murni (crystal papain).Papain kasar (crude papain) adalah getah pepaya yang telah dikeringkan, kemudian dihaluskan hingga menjadi berbentuk tepung.Papain murni (crystal papain) adalah hasil pemisahan dan pemurnian papain kasar menjadi empat macam protein proteolitik yaitu papain, chimopapain A, chimopapain B dan papaya peptidase A.

Getah pepaya (papain) cukup banyak mengandung bebagai macam enzim yang bersifat proteolitik (pengurai protein).Adapun sifat enzim proteolitik adalah senang menyerang bahan bahan protein dalam makanan. Bila enzim ini dicampurkan dalam makanan maka protein makanan akan tepecah pecah menjadi bentuk yang lebih sederhana yaitu asam amino.

Beberapa jenis industri yang memanfaatkan papain antara lain sebagai berikut: 1. Industri minuman, sebagai penjernih dan penambah citarasa (taste) pada bir 2. Industri pengolahan daging

3. Industri pengolahan ikan

4. Industri pengolahan makanan lain 5. Industri farmasi / obat obatan

6. Industri kosmetik, industri tekstil, industri penyamak kulit, dan sebagainya (Warisno,2003).

Suatu enzim yang penting yang telah luas dipelajari adalah papain. Ini adalah protease yang serba guna untuk sintesis peptida dikarenakan luasnya spesifitas substrat (Theppakorn et al.,2004).

Papain, protease thiol yang terdapat pada getah Carica Papaya, menghasilkan aktivitas proteolitik yang luas dan adalah enzim dengan tingkat penelitian yang tinggi, serta mempunyai aplikasi industri yang luas. Pada industri makanan, papain digunakan untuk mengempukkan daging dan turunan lainnya, untuk menghasilkan papain hidrolisat, untuk produksi keju dalam industri dairi,dll (Homaei et al., 2009).

Beberapa protease termasuk papain dapat menghidrolisis ikatan peptida dari kolagen dan keratin pada kulit. Papain adalah salah satu senyawa yang penting dalam produk kosmetik (Kiling et al.,2002).

2.4. Imobilisasi enzim

Imobilisasi enzim merupakan konsep yang cukup baru dan sangat menarik perhatian pada industri yang menggunakan enzim.Misalnya, pada industri makanan, enzim dimasukkan bersama dengan substrat dan reaksi dibiarkan untuk berlangsung. Ketika perubahan yang diinginkan telah tercapai maka enzim dinonaktifkan dengan cara pemanasan atau merubah pH dalam sistem. Jadi penggunaan dari enzim adalah sekali pakai, sedangkan pemurnian enzim sangat mahal. Untuk mengatasi masalah ini maka enzim diikat pada senyawaan yang tidak larut yang disebut sebagai matrik sehingga enzim dapat mengikuti reaksi dan dapat diambil kembali setelah selesainya reaksi.Pengikatan enzim pada matriks yang tidak larut dalam air ini disebut sebagai imobilisasi (Jhonson, 1978).

Suatu enzim yang teramobil adalah yang gerakannya dalam ruang dibatasi secara sempurna atau hanya dalam daerah yang sangat terbatas.Pada umumnya dalam keadaan demikian, enzim dibentuk menjadi tidak larut dalam air dengan beberapa tujuan. Pertama bentuk demikian akan memudahkan untuk memperoleh kembali enzim dari cairan media yang merupakan faktor penting dalam ekonomi reaktor

enzim. Kedua, bagi seorang ahli kimia sangat berguna sebagai model sistem bagi enzim yang secara normal berhubungan dengan membrane sel hidup (Yudoamijoyo,1992).

Walaupun syarat mutlak dalam pemilihan matriks untuk imobilisasi adalah ditentukan berdasarkan jenis enzim dan aplikasi yang diinginkan, jelaslah bahwa material yang digunakan adalah kompatibel dengan enzim. Proses imobilisasi juga dalam keadaan kamar sehingga tidak dapat mendenaturasikan enzim selama penyiapan (Taqieddin and Amiji, 2003).

2.4.1. Metode imobilisasi

Metode untuk immobilisasi enzim dapat dibagi atas 3 kategori dasar,yaitu: 1. Metode carrier-binding

Metode ini dibagi menjadi tiga berdasarkan cara pengikatan enzimnya, yaitu adsorpsi fisika, pengikatan ionik dan pengikatan kovalen.

a. Metode adsorpsi fisika

Metode ini berdasarkan pada adsorpsi fisika dari protein enzim pada permukaan pembawa yang tidak larut dalam air. Kelemahan dari metode ini dimana enzim yang diserap dapat bocor selama pemakaian karena gaya ikat antara protein enzim dan pembawa lemah.

b. Metode pengikatan ionik

Metode pengikatan ionik berdasarkan pengikatan ionik dari protein enzim pada pembawa yang tidak larut dalam air yang mengandung residu penukar ion.Kelemahan metode ini dimana kebocoran dapat terjadi dimana dalam larutan substrat dengan kekuatan ionik yang tinggi atau pada variasi pH.

c. Metode pengikatan kovalen

Pada metode ini diperlukan kondisi reaksi yang sulit dan biasanya dilakukan tidak dalam keadaan kamar.Dalam beberapa kasus, ditemukan bahwa ikatan kovalen mengubah bentuk konformasi dan pusat aktif enzim yang mengakibatkan kehilangan aktivitas atau perubahan spesifitas aktivitas.

Metode ini berdasarkan pembentukan ikatan kimia seperti dalam metode ikat kovalen, namun pembawa yang tidak larut dalam air tidak digunakan dalam metode ini.Imobilisasi enzim dilakukan dengan pembentukan ikat silang intermolekuler diantara molekul enzim dengan penambahan reagent bi- atau multifungsional.

3. Metode penjebakan (entrapping)

Metode penjebakan berdasarkan pengikatan enzim dalam kisi matriks polimer atau melingkupi enzim dalam membrane semipermeabel dan dibagi menjadi tipe kisi dan mikrokapsul.

a. Tipe kisi (lattice type)

Metode penjebakan tipe kisi meliputi penjebakan enzim dalam bidang batas (interstitial space) dari suatu ikat silang polimer yang tidak larut dalam air misalnya gel matriks.

b. Mikrokapsul

Penjebakan dengan cara mikrokapsul melibatkan pelingkupan enzim dengan membran polimer semipermeable. Prosedur untuk mikroenkapsulasi enzim dapat dibagi ke dalam tiga kategori, yaitu:

1. Polimerisasi interfasial

2. Pengeringan cair (liquid drying)

Gambar 5 Metode Imobilisasi

Teknik penjebakan yang umum untuk mikroorganisme dalam butiran adalah ionotropic gelation dari makromolekul dengan kation multivalensi.Penjebakan dapat terjadi dengan mencampurkan mikroorganisme dengan polimer anionik dan kemudian diikat silang larutan tersebut dengan kation multivalensi sehingga membentuk struktur yang menjebak mikroorganisme tersebut (Liouni, 2007).

Stabilitas dari enzim ditentukan dengan lamanya pemakaian dimana enzim tersebut masih aktif dan dapat mengkatalisis.Stabilitas dari enzim berdasarkan teknik imobilisasi yang digunakan (Jhonson, 1978).

2.4.2.Mikroenkapsulasi

Mikroenkapsulasimerupakan suatu teknologi yang berkembang pesat. Mikroenkapsulasi merupakan suatu cara penggunaan penyalut yang realtif tipis pada partikel partikel zat padat atau tetesan cairan dan dispersi (Lieberman, 1994).

Mikroenkapsulasi merupakan teknologi yang sedang berkembang yang sangat menarik terutama dalam bidang bahan pangan. Proses mikroenkapsulasi adalah teknik

untuk menghasilkan pembungkus polimer yang seragam, yang disebut mikrokapsul, dimana digunakan untuk membungkus partikel padatan, tetesan cairan murni dan larutan, serta dispersi. Mikrokapsul mempunyai ukuran yang bervariasi dari perpuluhan mikro hingga beberapa ribu mikro.Istilah enkapsulasi juga digunakan beberapa ilmuwan dalam menjelaskan ukuran mikrokapsul yang lebih besar (Jhonson, 1978).

Mikroenkapsulasi dibedakan dengan mudah dari teknik penyalutan makro, dimana mikroenkapsulasi meliputi penyalutan partikel dengan dimensi yang berkisar dari per puluhan mikron sampai 5000 mikron dalam ukuran.Mikroenkapsulasi memberikan sarana mengubah cairan menjadi zat padat, mengubah sifat koloidal dan sifat sifat permukaan, memberi perlindungan terhadap pengaruh lingkungan, serta mengontrol pelepasan karakteristik atau penyediaan bahan bahan tersebut.

Keunikan dari mikroenkapsulasi adalah kecilnya partikel yang tersalut dan penggunaan lebih lanjut serta adaptasi terhadap berbagai bentuk takaran dan penggunaan produk (Lieberman, 1994).

Prinsip dasar dari mikroenkapsulasi yang digunakan dalam transplantasi sel adalah perlindungan sel dari sistem imun sambil membiarkan sel yang terlingkupi tersebut bertahan dan mengeluarkan produk pengobatan. Membran mikrokapsul adalah semi permeable yang membiarkan keluarnya produk sambil melindungi masuknya makromolekul ke dalam.

Proses mikroenkapsulasi dapat digunakan secara efektif dalam mengubah cairan menjadi padatan, memisahkan bahan yang reaktif, mengurangi toksitas dari suatu bahan, mengubah sifat permukaan serta mengatur pelepasan suatu bahan. Mikroenkapsulasi juga dapat melindungi bahan yang sensitif terhadap udara.Jika polimer yang biodegradasi digunakan sebagai pembungkus, maka zat seperti enzim dan mikroorganisme dapat melindungi pelepasan yang terjadi. Mekanisme yang penting dalam pelepasan mikrokapsul adalah proses difusi. Jika bahan yang mudah larut dalam airdimikroenkapsulasi dalam matrik yang tidak larut dalam air, maka kandungan mikrokapsul dapat diekstraksi dengan air (Jhonson, 1978).

2.4.3. MikroenkapsulasiAlginat - Kitosan

Kompleks polielektrolit dibentuk melalui interaksi suatu polielektrolit dengan polielektrolit lain yang berlawanan muatan dalam larutan berair. Kompleks

polielektrolit banyak diaplikasikan dalam pembuatan membrane, pelapis antistatik, sensor lingkungan, detektor kimia, dan bahan medis prostetik. Di antara aplikasi tersebut di atas, yang luas digunakan sebagai membran untuk dialisis, ultrafiltrasi, proses pemisahan solut dan juga bisa digunakan untuk membran mikrokapsul (Kumar, 2000).

Beberapa polimer seperti kitosan, poliakrilat, alginat, asam poliamino, dan poliamida telah digunakan untuk membuat mikrokapsul.Mikrokapsul alginat polilisin alginat (APA) adalah mikrokapsul yang telah banyak dipelajari karena tingginya biokompabilitas dan karakteristik yang baik dalam jaringan sel.

Dengan berkembangnya pembelajaran mengenai kitosan sebagai biomaterial, maka mikrokapsul alginat kitosan alginat (ACA) telah dikembangkan untuk menggantikan polilisin yang harganya cukup mahal.Mikrokapsul ACA ini menarik banyak perhatian dikarenakan bagusnya biokompatibilitas dan harga yang lebih rendah serta melimpahnya kitosan di alam (Qi et al., 2005).

Mikrokapsul alginat kitosan dapat dibuat dengan metode yang berbeda.Salah satunya yaitu prosedur dua tahap dimana butiran gel Ca alginat dihasilkan dengan meneteskan larutan alginat ke dalam larutan yang mengandung ion kalsium.Kemudian butiran tersebut dipindahkan ke dalam larutan kitosan untuk membentuk membran luar butiran.Selain itu, kapsul dapat dibuat dengan metode satu tahap saja yaitu hanya dengan meneteskan larutan alginat ke dalam larutan kitosan (Gaserod et al., 1998).

Untuk mengurangi porositas dan meningkatkan stabilitas, mikropartikel alginate dilapisi dengan kitosan melalui interaksi elektrostatis.Muatan negatif dari gugus asam karboksilat dari alginat terikat secara ionik dengan muatan positif gugus amino dari kitosan, polimer kationik untuk membentuk kompleks polielektrolit berdasarkan perbedaan muatannya. Lebih lanjut, kitosan dilaporkan akan meningkatkan absorpi dari beberapa senyawaan (Silva et al., 2006).

McKnight et al (1988) menghasilkan mikrokapsul alginat kitosan dengan berat molekul 20000 untuk digunakan dalam teknik kultur sel dan dalam teknologi pengatur pelepasannya. Membrane kitosan dapat dibentuk di luar ataupun didalam dari kapsul tersebut.

Tanaka et al (1984) menentukan bahwa sifat difusi bergantung pada berat molekul dari zat aktif dan konsentrasi alginate dalam sel, namun tidak dipengaruhi

oleh konsentrasi kalsium klorida yang digunakan dalam pembentukan gel (Polk et al., 1993).

Kapsul alginat yang dilapisi dengan kitosan untuk penjebakan sel ragi yang digunakan dalam fermentasi alkohol.Dimana kompleks membran polielektrolit yang terbentuk ini menurunkan kebocoran dari sel yang dijebak dalam media (Liouni et al., 2007).

Kitosan yang dilapisi alginat dipilih untuk digunakan sebagai pembawa untuk model protein yaitu hemoglobin (Hb). Kitosan yang dilapisi alginat ini mampu menurunkan laju pelepasan Hb namun pelepasan tidak sempurna yang terjadi (Silva et al., 2006).

Taqieddin dan Mansoor membuat mikrokapsul alginat kitosan yang digunakan untuk pengembangan matriks pada imobilisasi enzim dimana protein akan tertahan sehingga dapat dilakukan pengontrolan permeabilitas terhadap substrat dan produk (Taqieddin and Amiji, 2003).

Mikrokapsul alginat kitosan menunjukkan efek jangka panjang dan efek jangka pendek yang baik dalam embolisasi arteri ginjal pada pengujian terhadap kelinci (Li et al., 2002).

Wen tao, et al, (2005) mengenkapsulasi Saccharomyces cerevisiae dalam mikrokapsul alginat kitosan dimana dengan peningkatan pembentukan membrane menurunkan kebocoran sel sehingga diharapkan dapat digunakan dalam makanan modifikasi mikroorganisme.

BAB III

BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. ALAT - ALAT

1. Gelas Beaker Pyrex

2. Gelas ukur Pyrex

3. Labu ukur Pyrex

4. Hot plate stirrer

5. Pipet mat Griffin

6. Spektrofometer UV Vis Shimadjzu 7. Magnetik bar

8. Neraca analitis

9. Inkubator Gallenkamp

10.Oven vakum Lab line

11.Erlenmeyer Pyrex

12.Cawan petri Normax

13.Corong Pyrex

14.Tabung reaksi Pyrex

3.2. BAHAN - BAHAN

1. Natrium Alginat Wako Pure Chemical 2. Kitosan

3. CaCl2.2H2O Merck

4. BSA (Bovine Serum Albumin) Merck

5. Kasein Merck

6. NaH2PO4.H2O Merck

7. Na2HPO4 Merck

8. Asam Trikloroasetat Merck 9. Asam Asetat Glasial Merck

10. Alkohol 96% Tehnis

11. Akuades

13. K Na Tartrat. 4H2O Merck

14. NaOH Merck

15. KI Merck

16. Getah pepaya (Carica papaya L)

17. L Tirosin Merck

3.3. PROSEDUR PENELITIAN 3.3.1. Pembuatan Larutan Pereaksi

3.3.1.1 Larutan Induk Standar Tirosin 1000 mg/L

Ditimbang 1 g tirosin dan ditambahkan HCl 1 N sedikit demi sedikit hingga larut kemudian dimasukkan kedalam labu takar 1000 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diperoleh larutan induk standar tirosin 1000 mg/L.

3.3.1.2. Larutan Standar Tirosin 100 mg/L

Dipipet 25 ml larutan induk standar tirosin 1000 mg/L dan dimasukkan kedalam labu takar 250 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diperoleh larutan standar tirosin 100 mg/L.

3.3.1.3. Larutan Seri Standar Tirosin

Dibuat konsentrasi larutan seri standar tirosin bervariasi 10;20;30;40;50;60;70;80;90 mg/L. Masing-masing dipipet sebanyak 2 ; 4 ; 6 ; 8 ; 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 18 ml larutan standar 100 mg/L dan dimasukkan kedalam labu takar 20 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. 3.3.1.4. Larutan Buffer Phosfat

Larutan A: Larutan NaH2PO4.H2O ( 2,76 g dalam 100 ml akuades ) Larutan B: Larutan Na2HPO4( 2,84 g dalam 100 ml akuades )

X ml Larutan A + Y ml Larutan B, dimasukkan kedalam labu takar 20 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

pH X(ml) Y(ml)

6 8,77 1,23

6,5 6,85 3,15

7 3,9 6,1

7,5 1,6 8,4

3.3.1.5. Larutan Alkohol 92%

Dimasukkan 95,8 ml alkohol 96% dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda (Warisno,2003)

3.3.1.6. Larutan CH3COOH 1%

Dilarutkan 1 ml CH3COOH glasial dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.3.1.7. Larutan NaOH 0,2N

Dilarutkan 4 g NaOHdengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.8. Larutan HCl 1 N

Dilarutkan 8,33 ml HCl(p) dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.3.1.9. Larutan Kasein 1%

Dilarutkan 1 g kasein dengan buffer phosphat pH 7 kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.10. Larutan Asam Trikloroasetat 30%

Dilarutkan 30 g asam trikloroasetat dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.11. Larutan Enzim Papain 1%

Dilarutkan 1 g enzim papain dengan buffer phosfat pH 7 kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.12. Pereaksi Biuret

Dilarutkan 3 g CuSO4.5H2O dan 9 g Na-K-Tartrat dengan NaOH 0,2 N kemudian dimasukkan kedalam labu takar 500 mL dan diencerkan sampai garis tanda, kemudian ditambahkan 5 g KI dan dimasukkan kedalam labu takar 1000 mL dan diencerkan dengan NaOH 0,2 N sampai garis tanda.

3.3.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi

3.3.2.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi Tirosin

3.3.2.1.1. Penentuan maks Larutan Standar Tirosin

Diambil larutan seri standar tirosin 50 mg/L dan diukur maksdengan melihat spectrum puncak serapan maksimum tirosin kemudian dilakukan pemeriksaan peakspectrumtirosin dan diperoleh makspada absorbansi maksimum.

3.3.2.1.2 Penentuan Kurva Kalibrasi Larutan Standar Tirosin

Dinolkan absorbansinya dengan blanko akuades. Masing-masing larutan seri standar tirosin 0;10;20;30;40;50;60;70;80;90 mg/L diukur absorbansinya pada maks 275 nm kemudian diplotkan konsentrasi dan absorbansi larutan seri standar

3.3.2.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi Bovin Serum Albumin (BSA) Metode Biuret 3.3.2.2.1. Penentuan maks Larutan BSA

Diambil salah satu konsentrasi larutan standar BSA dan diukur maksdengan melihat spectrum puncak serapan maksimum BSA kemudian dilakukan pemeriksaan peakspectrumBSA dan diperoleh makspada absorbansi maksimum.

3.3.2.2.2. Penentuan Kurva Kalibrasi Larutan BSA

Dinolkan absorbansinya dengan blanko akuades. Dipipet masing-masing 0;0,1;0,2;0,4;0,6;0,8mL larutan standar BSA dan ditambahkan masing-masing akuades hingga volume total masing-masing menjadi 4 ml kemudian ditambahkan masing-masing 6 ml pereaksi biuret, diukur absorbansinya pada maks 549 nm kemudian diplotkan konsentrasi dan absorbansi larutan seri standar.

3.3.3. Preparasi Sampel Getah Pepaya (Carica papayaL)

Digores buah pepaya muda dengan menggunakan bambu runcing, dan ditampung getah pepaya pada gelas Beaker.

3.3.4. Isolasi Crude Enzim Papain dari Getah Pepaya (Carica papayaL) dengan metode Balls dan Lineweaver

Sebanyak 7 ml getah pepaya ( Carica papaya L ) dimasukkan kedalam gelas Beaker 250 mL. Kemudian ditambahkan alkohol 92% sebanyak lima kali volume getah pepaya dan disimpan ditempat yang dingin, kemudian disaring. Residunya dikeringkan didalam oven vakum pada suhu 40o_{C(Warisno,2003).}

3.3.5. Penentuan Kadar Protein Enzim Papain Metode Biuret

Dipipet 1 mL larutan papain 1% dan dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan akuades hingga volume total adalah 4 ml, ditambahkan 6 ml Pereaksi Biuret dan didiamkan selama 6 menit pada suhu kamar, dan diukur absorbansinya pada maks549 nm.

3.3.6. Pengujian Aktivitas Crude Enzim Papain metode Murachi 3.3.6.1. Pengujian Suhu Optimum Crude Enzim Papain

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 6 buah gelas beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu 40,45,50,55,60,65,70o_{C selama 20 menit.} Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu yang sama selama 20 menit dan disaring.Kemudian diukur absorbansi masing-masing filtrat pada maks 275 nm (Sebayang,2006)

3.3.6.2. Pengujian pH Optimum Crude Enzim Papain

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 5 buah gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat dengan variasi pH 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ;8 untuk masing-masing gelas Beaker dan diinkubasi pada suhu 55oC selama 20

menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 55o_{C selama 20 menit dan disaring. Kemudiandiukur} absorbansi masing-masing filtrat pada maks275 nm.

3.3.6.3. Pengujian Aktivitas Crude Enzim Papain

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan dengan 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat pH 7 kemudian diinkubasi pada suhu 55o_C selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 55o_{C selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur} absorbansi filtrat pada maks275 nm.

3.3.7. MikroenkapsulasiCrude Enzim Papain

Disediakan 2 gelas Beaker, ke dalam gelas Beaker I dimasukkan 0,6 g Na alginat dan dilarutkan dengan 30 mL akuades, kemudiandiaduk selama 15 menit kemudian ditambahkan 10 ml larutan enzim papain 1%. Ke dalam gelas Beaker II dimasukkan sebanyak 0,2 g kitosan yang dilarutkan dengan 10 mL CH3COOH 1% dan diaduk kemudian ditambahkan 30 ml larutan CaCl2 2%. Diteteskan larutan Na Alginat ke dalam larutan kitosan dan disaring kemudian mikrokapsul yang terbentuk dicuci dengan akuades.Larutan hasil pencucian diuji kadar protein dengan metode Biuret (modifikasi prosedur dari Hwang et al.,1985)

3.3.8. Penentuan Kadar Enzim Papain Yang Tidak Terenkapsulasi

Dipipet 1 mL larutan hasil pencucian mikrokapsul dan dimasukkan kedalam tabung reaksikemudian ditambahkan akuades hingga volume total adalah 4 ml, dan ditambahkan 6 ml Pereaksi Biuret kemudian didiamkan selama 6 menit pada suhu kamar, dan diukur absorbansi pada maks549 nm.

3.3.9. Pengujian Aktivitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain

3.3.9.1. Pengujian Suhu Optimum Mikrokapsul Crude Enzim Papain

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 6 buah gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan masing 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi

masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu 40,45,50,55,60,65,70o_{C selama 20 menit.} Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu yang sama selama 20 menit dan disaring.Kemudian diukur absorbansi masing-masing filtrat pada maks275 nm 3.3.9.2. Pengujian pH Optimum Mikrokapsul Crude Enzim Papain

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 5 buah gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat dengan variasi pH 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ;8 untuk masing-masing gelas Beaker dan diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20} menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60o_{C selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur} absorbansi masing-masing filtrat pada maks275 nm.

3.3.9.3 Pengujian Aktivitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam} trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60o_{C selama 20 menit dan} disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm.

3.3.10. Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain

3.3.10.1. Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain Pada Suhu 25o_C Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam} trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60o_{C selama 20 menit dan} disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm. Kemudian dipisahkan mikrokapsul dari endapan protein dan dicuci dengan akuades.Mikrokapsul tersebut disimpan pada temperatur 25o_{C untuk digunakan kembali padapengujian pemakaian} berulang ke 2,3,4,5,6,7 dan 8.

3.3.10.2.Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain Pada Suhu 10o_C Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam} trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60o_{C selama 20 menit dan} disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm. Kemudian dipisahkan mikrokapsul dari endapan protein dan dicuci dengan akuades.Mikrokapsul tersebut disimpan dalam temperatur 10o_{C untuk digunakan kembali padapengujian pemakaian} berulang ke 2,3,4,5,6,7 dan 8.

3.4. BAGAN PENELITIAN

3.4.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi

3.4.1.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi Tirosin

1 g tirosin

ditambahkan HCl 1 N sedikit demi sedikit hingga larut

dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml diencerkan dengan akuades hingga garis tanda tirosin 1000 mg/L

dipipet 25 ml

dimasukkan ke dalam labu takar 250 ml diencerkan dengan akuades hingga garis tanda tirosin 100 mg/L

dipipet 10 ml

dimasukkan ke dalam labu takar 20 ml

diencerkan dengan akuades hingga garis tanda

diukur absorbansinya panjang gelombang maks

dipipet masing - masing

2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18 ml dimasukkan ke dalam labu takar 20 ml

diencerkan dengan akuades hingga garis tanda

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 275 nm

3.4.1.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi Bovin Serum Albumin (BSA) Metode Biuret

larutan BSA 5 mg/ml

dipipet sebanyak 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi

ditambahkan akuades hingga volume total masing - masing tabung reaksi adalah 4 ml ditambahkan masing - masing

6 ml pereaksi biuret larutan ungu

diukur absorbansi salah satu konsentrasi BSA panjang gelombang maks

diukur absorbansi pada panjang gelombang 549 nm

3.4.2. Preparasi Sampel Getah Pepaya (Carica papaya L)

3.4.5. Pengujian Aktivitas Crude Enzim Papain

3.4.5.2. Pengujian pH Optimum Crude Enzim Papain 1 ml kasein 1%

dimasukkan kedalam gelas Beaker

ditambahkan 16 ml buffer phosphat dengan variasi pH 6; 6,5; 7; 7,5; 8

diinkubasi masing-masing gelas Beaker pada suhu 55o_{C selama 20 menit}

ditambahkan 2 ml asam trikloroasetat 30% diinkubasi pada suhu 55o_{C selama 20 menit}

disaring

ditambahkan 1 ml crude enzim papain 1%

residu filtrat

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 275 nm hasil

3.4.6. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain *

3.4.8. Pengujian Aktivitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain

3.4.8.1. Pengujian Suhu Optimum Mikrokapsul Crude Enzim Papain

1 ml kasein 1%

dimasukkan kedalam gelas Beaker

ditambahkan 16 ml buffer phosphat pH 7

diinkubasi masing-masing gelas Beaker pada variasi suhu 40,45,50,55,60,65,70o_{C selama 20 menit}

ditambahkan 2 ml asam trikloroasetat 30%

diinkubasi pada variasi suhu yang sama selama 20 menit disaring

ditambahkan 4,46 g mikrokapsul

residu filtrat

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 275 nm hasil

3.4.8.3 Pengujian Aktivitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain

1 ml kasein 1%

dimasukkan kedalam gelas Beaker

ditambahkan 16 ml buffer phosphat pH 7 diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit}

ditambahkan 2 ml asam trikloroasetat 30% diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit}

disaring

ditambahkan 4,46 g mikrokapsul

residu filtrat

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 275 nm hasil

3.4.9. Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain

3.4.9.1. Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain Pada Suhu 25o_C

1 ml kasein 1%

dimasukkan kedalam gelas Beaker

ditambahkan 16 ml buffer phosphat pH 7 diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit}

ditambahkan 2 ml asam trikloroasetat 30% diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit}

disaring

ditambahkan 4,46 g mikrokapsul

residu filtrat

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 275 nm hasil

dipisahkan mikrokapsul dicuci dengan akuades digunakan untuk pengujian stabilitas berikutnya hasil

3.4.9.2.Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain Pada Suhu 10o_C

1 ml kasein 1%

dimasukkan kedalam gelas Beaker

ditambahkan 16 ml buffer phosphat pH 7 diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit}

ditambahkan 2 ml asam trikloroasetat 30% diinkubasi pada suhu 60o_{C selama 20 menit}

disaring

ditambahkan 4,46 g mikrokapsul

residu filtrat

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 275 nm hasil

dipisahkan mikrokapsul dicuci dengan akuades digunakan untuk pengujian stabilitas berikutnya hasil

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HasilPenelitian

4.1.1. Isolasi Crude Enzim Papain dariGetahPepaya

Dari 7 ml getahpepayadenganmassaadalah 26,97 gram diperoleh crude enzim papain sebanyak 4,4 gram.Rendemenadalahsebesar 16%

4.1.2. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain

Mikroenkapsulasi crude enzim papain dilakukandenganmatrikspendukungCa AlginatdanKitosandimanajumlahenzim yang terikatadalah 74 % yang dihitungdenganpenentuan protein bebasmetode biuret.Penggunaan crude enzimbebas 1% adalah 10 ml dimanadalam 1 ml crude enzim papain 1% terkandung protein bebassebesar 12,202 mg dankandungan protein bebasdalam air pencucianmikrokapsuladalah 31.85 mg, maka

% terenkapsulasi = x 100%

= 74%

No Volume (ml)

Crude Enzim Papain Crude

EnzimTidakTerenkapsulasi Abs Massa Protein Standar

(mg) Abs

Massa Protein Standar (mg)

1. 1 _0.2721 12,202 0,0145 0,637

Pengolahan Data Terlampir

Hasilpengujianjugamenunjukkanbahwaaktivitasdarimikrokapsul crude enzim papain mengalamikenaikanwalaupunhanyasedikitsaja.

Tabel 3 Aktivitasdari Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

No AktivitasEnzim (ppm)*

Crude Enzim Papain Mikrokapsul Crude Enzim Papain

1 _{92,807 114,983}

Pengolahan data terlampir

* AktivitasEnzimdinyatakansebagaijumlahtirosin yang dibebaskan (ppm) dengansubstratkasein.

4.1.3. PenentuanKondisi Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

4.1.3.1. PenentuanSuhu Optimum

Tabel 4 Data PengaruhSuhuPadaAktivitas Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

No Suhu (o_C)

Crude Enzim Papain Mikrokapsul Crude Enzim Papain Abs *AktivitasEnzim

(ppm) Abs

*AktivitasEnzim (ppm)

1 40 0.2167 _39.451 0.2156 _39,246

2 45 0.2732 _50.007 0.3405 _62,580

3 50 0.4994 _92.266 0.5140 _94,993

4 55 0.6228 _115.319 0.5807 _107,454

5 60 0.5541 _102.485 0.6230 _115,357

6 65 0.4447 _82.047 0.4321 _79,693

7 70 0.2759 _50.511 0.2234 _40,703

PerhitunganTerlampir

* AktivitasEnzimdinyatakansebagaijumlahtirosin yang dibebaskan (ppm) dengansubstratkasein.

4.1.3.2. Penentuan pH Optimum

Tabel 5 Data Pengaruh pH PadaAktivitas Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

No pH

Crude Enzim Papain Mikrokapsul Crude Enzim Papain Abs *AktivitasEnzim

(ppm) Abs *AktivitasEnzim(ppm)

1 6 0.2889 _52,940 0.1473 _26,486

2 6,5 0.3080 _56,508 0.2156 _39,246

3 7 0.5023 _92,807 0.621 _114.983

4 7,5 0.2979 _54,621 0.3929 _72,369

PerhitunganTerlampir

* AktivitasEnzimdinyatakansebagaijumlahtirosin yang dibebaskan (ppm) dengansubstratkasein.

4.1.4. PengukuranStabilitasMikrokapsul Crude Enzim Papain denganSuhuPenyimpanan 25o_{C dan 10}o_C

Tabel 6 Data PengujianStabilitaspadaPemakaianBerulangdenganSuhuPenyimpanan 25o_{C dan 10}o_C

Pemakaian Ke

Suhu 25o_{C Suhu 10}o_C

Abs *AktivitasEnzim

(ppm) Abs *AktivitasEnzim (ppm)

1 0.621 _114,983 0,621 _114,983

2 0.3361 _61,789 0.3819 _70,350

3 0.2499 _45,677 0.2745 _50,275

4 0.2208 _40,237 0.2041 _37,116

5 0.2190 _39,901 0.1985 _36,069

6 0.1878 _34,069 0.1923 _34,910

7 0.1799 _32,593 0.1898 _34,443

8 0.1648 _29,770 0.1778 _32,200

PerhitunganTerlampir

* AktivitasEnzimdinyatakansebagaijumlahtirosin yang dibebaskan (ppm) dengansubstratkasein.

4.2. Pembahasan

4.2.1. Isolasi Crude Enzim Papain

Setelahgetahpepayadisadapdaribuahpepayamudadilakukanpengukuran volume danpengukuranberat yang dibandingkandenganberat crude enzim papain yang diperolehmakadidapatkanrendemensebesar 16%.Isolasi crude enzim papain

dilakukandenganmetode Balls danLineweaver (Warisno,2003). Getahpepaya yang diperolehkemudiandiendapkandenganpenambahanalkohol 92% yang kemudiandikeringkandalam oven vakumpadasuhu 40o_{C.Enzim papain yang} didapatkanadalahbelummurni (crude), karenauntukmemperoleh papain yang murniadalahdenganmemisahkankandungankeempatenzimproteolitik (papain, chimopapainA, chimopapain B, dan papain peptidase A) dari papain (Moehd, 1996).

4.2.2. Mikroenkapsulasi Crude Enzim Papain

Penjebakan (entrapment) dari crude enzim papain adalahdenganmetodemikrokapsuldenganpemakaianpenjebakadalahCa

AlginatdanKitosan.DimanablokGuluronatdari Na Alginatakanbereaksidengan ion Ca+2_{dari CaCl}

2danmembentukstrukturmenyerupaitelurdalamkotaknya (egg in an egg box) dikarenakanterjadinyaikatsilang (cross linking). KemudiandenganpenambahankitosanmakaakanterjadiinteraksiblokManuronatdariAlgi natdenganpolikationikkitosanmembentukpolielektrolit.

Padapembuatanmikrokapsul crude enzim papain, konsentrasi Na Alginatdankitosan yang digunakanadalahsebesar 2% yang merupakanmodifikasidariprosedur yang telahdilakukanoleh Hwang, et al padatahun 1985 dimanadengankonsentrasi Na Alginatdankitosan yang lebihkecildari 2% tidakterbentukmikrokapsul. Sedangkanpengujianpadakonsentrasi di atas 2% belumditeliti.

Dari mikroenkapsulasididapatkanbahwaenzim yang terkapsuladalahsebesar 74% yang dihitungberdasarkanpenentuankadar protein metode biuret. Dari hasilpengujianjugaditemukanbahwaaktivitasdarimikrokapsul crude enzim papain mengalamikenaikan. Hal initerjadikarenaenzim yang terjebakberadadalamkeadaan yang lebihstabilkarenaterjadinyakonformasienzim yang

samadengankonformasisubstrat (lock and key)

denganbantuaninteraksimatrikspembungkusnya yang bersifatpolielektrolitdimanaCa Alginatbersifatpolianionikdankitosanadalahpolikationiksehinggaenzimlebihstabil.Nam unkarenaadanyahalangansteriksaatsubstratmasukkedalammikrokapsulmenyebabkanke

naikanaktivitas yang sedikitsaja.Akan tetapi,

penyebabpastidarikenaikanaktivitasenzimterankapsulasibelumdiketahuisecarapasti.

4.2.3. PenentuanKondisi Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

Penentuanaktivitasdarimikrokapsul crude enzim papain adalahdenganpenambahansubstrat (kasein) dimanamikrokapsul crude enzim papain akanmenghidrolisiskaseinmenghasilkanbeberapaasam amino salahsatu di antaranyaadalahtirosin.

Gambar 7 ReaksiEnzimatisdari Crude Enzim Papain

Untukmenonaktifkanenzimtersebutsertamengendapkan protein sisamakaditambahkanasamtrikloroasetat.Dimanatirosin yang dihasilkandianalisadenganmetodespektrofotometer UV padapanjanggelombang

275nm.Tirosindapatdianalisapadaspektrofotometer UV

dikarenakanadanyaikatandienaterkonjugasipadastrukturnya.

4.2.3.1. PengaruhSuhu Optimum

Pengaruhsuhuterhadapaktivitas crude enzim papain danmikrokapsul crude enzim papain dapatdilihatsepertipadagambarberikut

Gambar 9 PengaruhTemperaturPadaAktivitas Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

Padagambar di atasdapatdilihatbahwaaktivitasdari crude enzim papain

danmikrokapsul crude enzim papain

adalahbertambahseiringdenganbertambahnyasuhu.Hal

inimungkindikarenakanenergikinetikdarimolekulsubstratdanmolekulenzim yang semakinmeningkatdenganbertambahnyasuhusehinggainteraksiantaraenzimdansubstrat semakinbertambah.Namun, di atasdarisuhu optimum (suhu yang menunjukkanaktivitasmaksimum) terlihatbahwaaktivitas yang terusmenurunsecaratajamkarenaterjadinyadenaturasidarienzimtersebutdanhalinidimun gkinkankarenaikatan ikatanhidrogen yang lemahpada crude enzim papain

mengalamipemutusansehinggamengubahkonformasidarienzimdanmenurunkanaktivita sdari crude enzim papain danmikrokapsul crude enzim papain.

Suhu optimum dari crude enzim papain adalah 55o_{C sedangkansuhu optimum} darimikrokapsul crude enzim papain adalah 60o_{C.Suhu optimum darimikrokapsul} yang

meningkatdisebabkankarenaterjadinyakonformasidaristrukturenzimdenganmatrikspem

bungkus (Ca Alginatdankitosan)

sehinggasubstratlebihmudahuntukmenembushalangansterik yang adadanpeningkatansuhuinimembuktikanbahwamatrikspembungkus yang digunakanmampumelindungi crude enzim papain padasuhu yang tinggi.

4.2.3.2. Pengaruh pH Optimum

Pengaruh pH terhadapaktivitas crude enzim papain danmikrokapsul crude enzim papain dapatdilihatsepertipadagambarberikut

Gambar 10 Pengaruh pH PadaAktivitas Crude Enzim Papain danMikrokapsul Crude Enzim Papain

Dari hasilpenelitiandiperoleh pH optimum adalahpada pH 7.pHberhubungandenganstrukturenzim yang merupakanasam asam amino. Perubahan pH dalamsuatularutanmenunjukkanperubahanjumlah ion H+ _yang adadalamlarutan.Perubahaninimempengaruhiaktivitasenzimdimanadapatmenyebabkan perubahankonformasidarienzim.Pada pH optimum yaitu pH 7, jumlah ion H+_{tidakmempengaruhikonformasidari crude enzim papain} sehinggakonformasienzimadalahsamadengankonformasisubstrat (lock and key). Sehinggapada pH ini, aktivitasenzimadalahaktivitas yang paling tinggi.

4.2.4. PengukuranStabilitasMikrokapsul Crude Enzim Papain denganSuhuPenyimpanan 25o_{C dan 10}o_C

Pengujianstabilitasmikrokapsulbertujuanuntukmengetahuiberapa kali crude enzim papain

terenkapsulasiinidapatdigunakandanmampuuntukmengkatalisissuatureaksi.Padapemak

aianberulangmikrokapsul crude enzim papain

didapatkanbahwamikrokapsulpadapenyimpanan 10o_{C setelahpemakaianke 8 kali} masihmenunjukkanaktivitassebesar 28% sedangkanmikrokapsulpadapenyimpanan 25o_{C menunjukkanaktivitassebesar 26% setelahpemakaianke 8.}

Gambar 11PengujianKestabilanpadaPemakaianBerulang

Penurunanaktivitasdisebabkankarenakestabilandandayakatalisdarimolekulenzimterseb ut.Faktorlingkunganjugaturutmempengaruhigugusfungsireaktifenzimpadapusataktifny a.Jikasuatuenzimseringdigunakanmakaakanmempengaruhipusatgugusaktifsehinggaak anterjadikonformasienzim yang menyebabkanpenurunanaktivitasdarienzimtersebut. Penurunanaktivitasjugadisebabkankarenamatrikspembungkus yang digunakanmengalamikerusakansehingga crude enzim papain terlepaspadasaatpencucianpadapemakaianke 8 kali.Walaupundemikian, mikrokapsulenzim papain inimemilikikeuntungankarenadapatdigunakansebanyak 8 kali secaraberulang.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasilpenelitiandapatdiperolehkesimpulansebagaiberikut :

1. Temperatur optimum dari crude enzim papain adalah 55o_{C dan pH optimum} adalah 7 denganaktivitassebesar 92,807 g/ml sedangkantemperatur optimum mikrokapsul crude enzim papain adalah 60o_{C dan pH optimum adalah 7} denganaktivitas 114,983 g/ml.

2. Mikrokapsul crude enzim papain

denganmatrikspembungkusCaAlginatdankitosandapatdigunakansebanyak 8 (delapan) kali secaraberulangdimanapadasuhupenyimpanan 25o_C masihmenunjukkanaktivitassebesar26%sedangkanpadasuhu 10o_C menunjukkanaktivitassebesar 28%.

5.2. Saran

Sebaiknyadilakukanpenelitianlebihlanjutmengenaipembuatanmikrokapsuldenganvaria sisubstratdanvariasikonsentrasisertavariasiwaktuinkubasidenganmatrikspendukungCa

Alginatdankitosansehinggadapatdigunakandalampemakaianberulang yang lebihbanyak.

DAFTAR PUSTAKA

Adriana, C., W.A.Mound, FM. Goycoolea, C.Peniche. 2003.Diffusion

Through Membrane of polyelectrolyte complex of Chitosan and Alginate. Macromol.Biosci, 3 : 535 539

Baruch, L and M.Machluf. 2006.Alginate Chitosan Complex Coacervation

for Cell Encapsulation: Effect on Mechanical Properties and On Long Term Viability.Biopolymers.Vol. 82. 570 579 (2006)

Cahyaningrum, S.E., R.Agustinidan N.Herdyastuti.2007.Pemakaian

KitosanLimbahUdangWinduSebagaiMatriksPendukungpadaImobilisasi Papain.AktaKimindo Vol. 2 No. 2 April 2007 : 93 98

Caserio, R. 1977.Basic Principles of Organic Chemistry.Second Edition.Will Benjamin Inc Menlo Park.California

Chibata, I. 1978.Immobilized Enzymes.Tokyo : Halsted Press Book

Gaman,P.M., K.B. Sherrington, 1992.IlmuPanganPengantarIlmuPanganNutrisi danMikrobiologi. EdisiKedua. Bandung: GadjahMada University Press. Gaserod, O., O.Smidsrod, G.Skjak Braek. 1998.Microcapsules of

alginate chitosan I A Quantitative sstudy of the interaction between alginate and chitosan. Biomaterials 19 (1998) 1815 1825

Grabovac, V., T.Schmitz, F.Foger, and A.Bernkop Schnurch.

2007.Papain : An Effective Permeation Enhancer for Orally Administered Low Molecular Weight Heparin.Pharmaceutical Research.Vol.24. No 5, May 2007

Homaei,A.A., R.H.Sajedi, R.Sariri, S.Seyfzadeh, R.Stevanato. 2009.Cysteine

enhances activity and stability of immobilized papain. Springer Verlag 2009 Hwang,C., C.K.Rha and A.J.Sinskey. 1985.Encapsulation With Chitosan : Trans

Membrane Diffusion Of Proteins in Capsules.3rd_{International Conference on} Chitin and Chitosan.

ISP Alginate.2003.The align/calcium reactions.

Jhonson, P. 1978. Encyclopedia of Food Science.Westpost, Connecticut : The Avi Pub.Co, Inc

Kaban, J. 2007.KarakteristikdanAplikasi Film Pelapiskompositkhelatlogam alkalitanahAlginat Kitosan. Disertasi. Medan

Kaban,J.,H.Bangun, A.K.Dawolo, Daniel. 2006.PembuatanMembran

KompleksPolielektrolitAlginatKitosan. JurnalSains Kimia. Vol 10. No 1.2006: 10-16

Killing, A., S.Onal and A.T. 2002.Stabilization of Papain by Modification with Chitosan. Turk J Chem 26 (2002) 311 316

Kumar, M.N.V. 2000.Nano and Microparticles as controlled drug Delivery Devices. J.Pharm Pharmaceutics. Scie 3(2) : 234 258

Kumar, M.N.V.2000.A Review of Chitin and Chitosan Application. Reactive & Functional Polymers 46, 1 26

Viewpoint. Biotechnology Advance

Li,Sha, X.Wang, X.Zhang, R.Yang, H.Zhang, L.Zhu, X.Hou.2002.Studies on alginate chitosan microcapsules and renal arterial embolization in rabbits. Journal of Controlled Release 84 (2002) 87 - 98

Lieberman, H.A. 1994.TeoridanPraktekFarmasiIndustri II. Jakarta :Penerbit Universitas Indonesia

Liouni, M., P.Richoutis, E.T.Nerantzis. 2007.Studies of the Mechanical Properties and the Fermentation Behavior of Double Layer Alginate Chitosan Beads, Using Saccharomyces cerevisiae Entrapped Cells. World J Microbial Biotechnol (2008) 24: 281 288

Mc Hugh, D.J. 2003.A Guide to Seaweed Industry. Food and Agric. Org of the UN, Rome

Meriaty. 2002.PembuatandanKarakterisasiMembranKalsiumAlginat. Tesis. Medan

Moehd,B.K.,1996.BertanamPepaya. Jakarta: PenebarSwadaya

Polk, A.E, B.Amsden, J.S.David, A.Gonzal, Augustine O.O &Mattheus F.A. Goosen. 1993.Oral Delivery in Aquaculture : Controlled Release of Proteins from Chitosan Alginate Microcapsules.Aquacultural Engineering 13 (1994) 311 323

Prakash, S and H.Soe Lin. 2004.Strategy for Cell therapy : Polymers for Live Cell Encapsulation and Delivery.Trends Biomate.Artif. Organs, Vol 18(1), pp 24 35

Qi, Wen - tao,J.Ma, W.Yu, Y.Xie, W.Wang, X.Ma. 2005.Behavior of microbial growth and metabolism in alginate chitosan alginate (ACA)

microcapsules. Enzyme and Microbial TECHNOLOGY 38 (2006) 697 704 Qi, Wentao, J.Ma, Y.Liu, X.Liu, Y.Xiong, Y.Xie, X.Ma. 2005.Insight into

Permeability of Protein through Microcapsule Membranes. Journal of Membrane Science 269 (2006) 126 132

Robinson, David S.1987.Food Biochemistry and Nutritional Value.Longman Scientific and Technical Longman Group, Jhon Willey and Sons.New York Sashiwa,H , N.Yamamori, Y.Ichinose, J.Sunamoto, andS.Aiba, 2003.Michael

Reaction of Chitosan with various Acryl Reagents in Water. Biomacromolecules.2003.4(5). 1250-1254

Sebayang,F. 2006.Imobilisasi Enzim Papain dariGetahPepayadenganAlginat. KomunikasiPenelitian MIPA. Vol. 18 No. 2 Juni 2006

Silva, C.M.,A.J.Riberio, M.Figueiredo, D.Ferreira, andF.Veiga. 2006.

Microencapsulation of Hemoglobin in Chitosan-coated Alginate Microspheres Prepared by Emulsification/Internal Gelation.The AAPS Journal 2006; 7(4) Article 8

Sugita, P., T.Wukisari, A.Sjahriza, D.Wahyono. 2009. KitosanSumber Biomaterial MasaDepan. Bogor : IPB Press

Lampiran 1 Data PengukuranTirosin Data

hasilpengukuranabsorbansilarutanseristandartirosindenganmenggunakanmetodespektr ofotometri UV Visible pada maks 275 nm, dapatdilihatdalamtabeldibawahini : Tabel 7 Data AbsorbansiKurvaKalibrasiTirosin

No Konsentrasi ( mg/L ) Absorbansi

1 0 0

2 10 0.059

3 20 0.121

4 30 0.174

5 40 0.217

6 50 0.269

7 60 0.311

8 70 0.391

9 80 0.433

Lampiran 2Pengolahan Data HasilPengukuranTirosin

No X Y (Xi - X) (Yi - Y) (Xi - X)2 _{(Yi - Y)}2 _{(Xi - X) (Yi - Y)}

1 0 0 -45 -0.2464 2025 0.06071 11.088

2 10 0.059 -35 -0.1874 1225 0.03512 6.559

3 20 0.121 -25 -0.1254 625 0.01573 3.135

4 30 0.174 -15 -0.0724 225 0.00524 1.086

5 40 0.217 -5 -0.0294 25 0.00086 0.147

6 50 0.269 5 0.0226 25 0.00051 0.113

7 60 0.311 15 0.0646 225 0.00417 0.969

8 70 0.391 25 0.1446 625 0.02091 3.615

9 80 0.433 35 0.1866 1225 0.03482 6.531

10 90 0.489 45 0.2426 2025 0.05885 10.917

450 2.464 0 0 8250 0.23693 44.16

Tabel 8 PenurunanPersamaanGarisregresiMetodeLeast SquareKurvaKalibrasiTirosin Dari tabel di atasdiperoleh :

X = = = 45 Y = = = 0,2464

Koefisienkorelasi r = = r = 0,9988

Persamaangarisregresiuntukkurvakalibrasidinyatakandengan Y = aX + b Dimana :

a =slope b =intersept

Hargaslope(a) dapatdiperolehdaripersamaansebagaiberikut :

a = =

a = 0,00535

Sedangkanhargaintersept(b) dapatdiperolehmelaluipersamaan : Y = aX + b atau b = Y aX

b = 0,2464 (0,00535)(45) b = 0,00553

dengandemikianpersamaangarisregresiuntukkurvakalibrasityrosinadalah : Y = aX + b

Dimana :Y = AbsorbansisampeldanX = Kadar tirosin ( µg/ml ) Lampiran 3 Data Pengukuran BSA ( Bovin Serum Albumin )

Data hasilpengukuranabsorbansilarutanstandar BSA ( Bovin Serum Albumin ) denganmenggunakanmetodespektrofotometri UV Visible pada maks 549 nm, dapatdilihatdalamtabeldibawahini :

Tabel 9 Data AbsorbansiKurvaKalibrasi BSA No Konsentrasi (mg/ml) Absorbansi

1 0 0

2 0,5 0.011

3 1 0.024

4 2 0.045

5 3 0.066

No X Y (Xi - X) (Yi - Y) (Xi - X)2 _{(Yi - Y)}2 _{(Xi - X) (Yi - Y)}

1 0 0 -1,75 -0,039 3,0625 0,001544 0,068775

2 0,5 0,011 -1,25 -0,028 1,5625 0,000801 0,035375 3 1 0,024 -0,75 -0,015 0,5625 0,000234 0,011475

4 2 0,045 0,25 0,006 0,0625 0,000032 0,001425

5 3 0,066 1,25 0,027 1,5625 0,000713 0,033375

6 4 0,09 2,25 0,051 5,0625 0,002570 0,114075

10,5 0,236 0 0 11,875 0,005895 0,2645

Tabel 10PenurunanPersamaanGarisregresiMetodeLeast SquareKurvaKalibrasi BSA (Bovin Serum Albumin)

Dari tabeldiatasdiperoleh :

X = = = 1,75 Y = = = 0,0393

Koefisienkorelasi r = = r = 0,9997

Persamaangarisregresiuntukkurvakalibrasidinyatakandengan Y = aX + b Dimana :

a =slope b =intersept

Hargaslope(a) dapatdiperolehdaripersamaansebagaiberikut :

a = =

a = 0,0223

Sedangkanhargaintersept(b) dapatdiperolehmelaluipersamaan : Y = aX + b atau b = Y aX

b = 0,0393 (0,0223)(1,75) b = 0,0003

dengandemikianpersamaangarisregresiuntukkurvakalibrasiBSA (Bovin Serum Albumin)adalah :

Dimana :Y = AbsorbansisampeldanX = Volume larutan BSA ( ml ) Lampiran5 DataPerhitungan Kadar Protein

Larutan protein standar yang digunakanadalahlarutan BSA 5 mg/ml Tabel 11 Data Kandungan Massa Protein Standar

Volume BSA (ml) Massa Protein Standar (mg)

0 0

0,1 0,5

0,2 1

0,4 2

0,6 3