Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri

29 responifresponsif JA secara negatif dalam sitoplasma. Protein ini berinteraksi dengan faktor transkripsi TGA dalam nukleus dibutuhkan untuk menginisiasi ekspresi gen PR Spoel et al. 2003. Mutan gen NPR1 tidak memperlihatkan sensitivitas terhadap SA. NPR1 diusulkan menjadi kunci pada SAR di ArabidopsisA. thaliana Cao et al. 1994; Cao et al. 1997; Cao et al. 1998. Peningkatan tingkat ekspresi NPR1 di ArabidopsisA. thaliana Chern et al. 2001 dan homolog NPR1 pada tanaman padi NPR-homolog 1 NH1 Chern et al. 2005 meningkatkan resistensi terhadap Xanthomonas oryzae. Ekspresi NPR1 secara negatif dikontrol oleh suppressor of npr1 inducible SNI1. SNI1 adalah regulator negatif pada SAR dan terepresi oleh NPR1. SA memperlihatkan peran nyata dalam sistem pertahanan baik secara lokal maupun sistemik pada tumbuhan termasuk padi. Pemberian Pseudomonas aeruginosa pada padi meningkatkan resistensi terhadap Rhizoctonia solani Saikia et al. 2006. Aplikasi SA secara eksogenus pada padi mampu mendorong resistensi terhadap Magnaporthe grisea Manandhar et al. 1998. Introduksi gen- gen penyandi lintasan biosintesis SA asal bakteri meningkatkan resistensi terhadap patogen pada tembakau Verberne et al. 2000 dan Arabidopsis A. thaliana Mauch et al. 2001. Tanaman padi mengandung tingkat konsentrasi SA yang tinggi dan memiliki kemampuan mengkonversi eksogenus SA menjadi glukosil-SA Silverman et al. 1995 sehingga memperlihatkan bahwa padi memiliki kemampuan menjaga basal SA. SA diduga menjadi pembatas kimiawi melawan infeksi patogen Yang et al. 2004.

3.4 Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri

Asam salisilat memiliki peran dalam mekanisme pertahanan tumbuhan terhadap cekaman biotik maupun abiotik. Pada saat terjadi cekaman biotik maka asam salisilat mempunya i peran penting dalam menginduksi SAR yang akhirnya mengaktifkan sejumlah gen PR pada cekaman biotik. Pada cekaman abiotik, asam salisilat berperan dalam mendetoksifikasi senyawa oksigen reaktif seperti superoksida dan H 2 O 2 . Defisiensi kandungan asam salisilat pada Oryza O. sativa mengakibatkan tanaman rentan akan kerusakan akibat cekaman oksidatif Yang et Formatted: Spanish Mexico Formatted: Justified, I ndent: First line: 0,95 cm, Line spacing: 1,5 lines 30 al. 2004. Pada saat cekaman biotik, SA akan menekan aktvitas APX dan CAT sehingga konsentrasi H 2 O 2 yang dihasilkan NADPH oksidase pada membran plasma tetap. Dengan demikian, tanaman secara simultan menghasilkan H 2 O 2 tetapi kehilangan kemampuan menghilangkan H 2 O 2 . Kejadian ini berlawanan pada saat tanaman terpapar cekaman abiotik di mana produksi ROS seperti H 2 O 2 ditekan. Kedua fungsi yang berlawanan dari ROS ini masih menjadi perdebatan Mittler 2002. Hal ini kemungkinan berhubungan dengan fungsi SA yang mengaktifkan SABP3 yaitu kloroplas karbonik anhidrase yang memiliki fungsi sebagai antioksidan Slaymaker et al. 2002. Shingga, defisiensi kandungan asam salisilat pada O. sativa mengakibatkan tanaman rentan akan kerusakan akibat cekaman oksidatif Yang et al. 2004. Tanaman mampu menghasilkan SA disamping melalui fenilalanin juga melalui isokorismat. SA yang dihasilkan melalui isokorismat pada ArabidopsisA. thaliana berperan dalam mekanisme pertahanan Wildermuth et al. 2001. Gen yang berperan dalam produksi SA melalui isokorismat adalah gen ICS1 dan ICS2 yang berlokasi pada kromosom 1 ArabidopsisA. thaliana . Introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis SA asal bakteri melalui isokorismat pada tanaman padi dapat meningkatkan resisten tanaman. Akumulasi SA melalui isokorismat pada padi belum pernah dilaporkan. Penyamaan urutan asam amino enzim ICS ArabidopsisA. thaliana dan padi memperlihatkan kesamaan sebesar 45. Padi mempunyai gen ICS yang berlokasi pada kromosom 9 Nipponbare dengan nomor aksesi NM_001069519 dan and CA763410 untuk Indica IR64. Kandungan SA padi berperan dalam mekanisme pertahanan terhadap cekaman biotik. Padi memperlihatkan kandungan SA yang lebih tinggi dibandingkan ArabidopsisA. thaliana dan tembakau. Padi mampu mempertahankan kandungan SA bebas yang cukup tinggi. Walaupun demikian, glukosil transferase padi terinduksi oleh pemberian SA dari luar. Aplikasi SA dan bakteri penghasil SA dari luar mampu meningkatkan sistem pertahanan terhadap serangan Magnaporthe grisea Manandhar et al. 1998 dan Rhizoctonia solani Saikia et al. 2006. Kandungan SA dan enzim yang mengkonversi SA memiliki lokasi yang berbeda Silverman et al. 1995. Ini menimbulkan spekulasi bahwa Formatted: Subscript Formatted: Subscript Formatted: Font: I talic 31 gen pertahanan yang dependen SA akan terinduksi apabila SA dihasilkan menyerupai pemberian SA dari luar. Introduksi gen asal bakteri memerlukan ketersediaan sinyal peptida yang mengarahkan ekspresi gen pada kompartemen tertentu pada sel. Sinyal peptida adalah penting untuk mengontrol ekspresi gen ICS isochorismate synthase. ICS1 ArabidopsisA. thaliana memiliki sinyal peptida Wildermuth et al. 2001. Rekayasa SA dengan menambahkan sinyal peptida pada fusi gen pchB-A yang dikontrol oleh promoter 35S dapat meningkatkan konsentrasi SA pada Arabidopsis A. thaliana Mauch et al. 2001. Penggunaan sinyal peptida dengan target ekspresi pada kloroplas di tembakau transgenik mampu meningkatkan kandungan asam salisilat Verberne et al. 2000. 32 BAHAN DAN METODE 1 Waktu dan tempat penelitian Penelitian dilaksanakan dari tahun 2001 sampai 2003. Penelitian dilakukan di laboratorium Clusius, Institute of Biology Leiden, Leiden University, The Netherlands . Kegiatan kloning, transformasi bakteri, dan molekuler analisis dilakukan di laboratorium Molecular and Developmental Genetics. Sedangkan kegiatan anatomi-histologi dan pengambilan gambar preparat dilakukan di Laboratorium Histologi. Percobaan untuk pemberian abiotik seperti kekeringan, salinitas, kejut-panas dan perlakuan perendaman dalam air dilakukan di ruang tumbuh untuk tanaman padi. Kegiatan uji kekeringan untuk tanaman transgenik Arabidopsis A. thaliana dilakukan pada ruang tumbuh ArabidopsisA. thaliana . Transformasi tanaman di laksanakan di laboratorium biosafety level 2. Pengukuran kadar asam salisilat beberapa kultivar padi dilakukan labor at orium Virology , Virology Department, Leiden University. Untuk pengukuran kandungan asam salisilat dari tanaman transgenik padi yang mengandung gen-gen introduksi asam salisilat asal bakteri dilakukan di Laboratorium CIRAD, Perancis. 2 Bahan penelitian Kultivar padi yang digunakan adalah IRAT112, Cabacu, Cisadane, Nipponbare, T-309, IR64, IR58, dan Taipei Tabel 2 dan Arabidopsis A. thaliana dari jenis Columbia. Kultivar padi IRAT112 dan Cabacu merupakan padi gogo, Cisadane dan IR64 adalah padi sawah, sedangkan Nipponbare dan T-306 merupakan padi model untuk transformasi. Beberapa strain bakteri yang digunakan untuk kegiatan kloning dan transformasi genetika tertera pada Tabel 3. Antibiotik Rifam fp icin dipakai untuk memelihara kultur Agrobacterium A. tumefaciens LBA4404 dan LBA1115. Sejumlah plasmid yang dipakai diperlihatkan tercantum dalam Tabel 4. Bakteri Escherichia E. coli mengandung plasmid rekombinan dipelihara dengan kandungan antibiotik setengah kali yang dipakai untuk Agrobacterium A. tumefaciens . Perunut untuk melabel pada analisis Northern dipaparkan pada Tabel 5. Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 33 Tabel 2 Jenis kultivar padi yang dipakai dalam percobaan cekaman abiotik No Kultivar Tipe Percobaan 1 IRAT112 Bibit Cekaman abiotik 2 Cabacu Bibit Cekaman abiotik 3 Cisadane Bibit Cekaman abiotik 4 Nipponbare 1.1. Kalus 2.2. Bibit 1.1. Transformasi 2.2. Cekaman abiotik 5 T-309 Bibit Cekaman abiotik 6 IR64 Bibit Cekaman abiotik Tabel 3 Jenis bakteri yang dipakai pada percobaan kloning dan transformasi No Bakteri Strain Percobaan 1 Escherichia E. coli DH5 α PR Κ2013 Kloning Helper 2 Agrobacterium A. tumefaciens 1. LBA4404 rif 20 2. LBA1115 rif 20 -Transformasi genetika padi -Transformasi genetika ArabidopsisA. thaliana Tabel 4 Daftar plasmid yang digunakan pada konstruksi gen No Plasmid Antibiotik Kegunaan Percobaan 1 TOPO Amp50Kan25 PCR cloning 2 pC1300 Kan 25 Vektor biner 3 pC1391Z Kan 25 Vektor biner 4 pMOG80 Kan 25 Vektor biner 5 365S-Oshox4 Kan 25 Vektor biner 6 RNAi-Oshox4 Kan 25 Vektor biner 7 DR5-GUS Kan 25 Vektor biner 8 PO4 Kan 25 Vektor biner Kan: kanamisin Amp: am fp isilin Tabel 5 Perunut yang digunakan untuk melakukan analisis Northern No Perunut Sumber Asal 1 Oshox 1-7 cDNA Rice Group, Leiden, Belanda 2 Salt Plasmid Rice Group, Gent, Belgia 3 Oshsp 16.9 Plasmid Rice Group, Leiden, Belanda 4 Oshox 8 Plasmid Gene Bank Gen Formatted Table Formatted: Bullets and Numbering 34 3 Metodologi penelitian Tahapan penelitian meliputi dua bagian terpisah Gambar 10, yaitu karakterisasi gen HD-Zip padi yang memperlihatkan respon kekeringan , dan introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yang berasal dari bakteri. 35 Gambar 10 Tahapan yang dilakukan dalam penelitian. Penelitian mempunyai dua bagian yang terdiri dari penggunaan HD-Zip kotak dan introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal 36 bakteri k segitiga untuk pembuatan padi transgenik. 3.1 Karakterisasi Gen HD-Zip padi responsif kekeringan 3.1.1