Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat

65 1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif dari 35S-CaMV

1.4.1 Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat

Gen Oshox4 difusikan dengan promoter 35S-CaMV selanjutnya disebut 35S-Oshox4. Gen lalu diintroduksikan ke dalam genom padi dan Arabidopsis untuk melihat pengaruh ekspresi berlebih dari gen HD-Zip padi Oshox4 pada tanaman padi dan kemungkinan penggunaannya untuk meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Tanaman transgenik padi Nipponbare yang mengandung 35S-Oshox4 memperlihatkan ekspresi gen 35S-Oshox4 lebih tinggi daripada tanaman kontrol Gambar 28A. Tanaman kontrol yang digunakan adalah tanaman transgenik yang mengandung konstruksi DR5-GUS. Konstruksi DR5- GUS adalah konstruksi ekspresi gen GUS yang diatur oleh promoter DR5. Kontrol transgenik dipakai untuk menunjukkan bahwa perubahan fenotipe yang terjadi pada padi transgenik yang mengandung gen 35S-Oshox4 bukan karena pengaruh insersi acak T-DNA. Semua tanaman transgenik padi yang mengandung peningkatan ekspresi gen Oshox 4 memperlihatkan fenotipe kerdil dengan reduksi tinggi tanaman. Tanaman transgenik yang mengandung tingkat ekspresi Oshox4 tinggi ini dapat dikelompokkan menjadi tiga, berdasarkan pertumbuhan vegetatifnya. Ketiga kelompok tersebut adalah kelompok dengan fenotipe vegetatif ringan, sedang, dan berat Gambar 28 B-D. Kelompok vegetatif ringan diartikan sebagai kelompok yang menunjukkan fenotipe pertumbuhan tidak berbeda dengan kontrol. Kelompok dengan kategori vegetatif sedang diartikan sebagai kelompok dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif berbeda dengan kontrol. Kelompok berat adalah kelompok dengan kondisi petrtumbuhan vegetatif sangat berbeda dengan kontrol. Formatted: Swedish Sweden Formatted: Dutch Netherlands Formatted: Dutch Netherlands 66 Gambar 28 Fenotipe padi transgenik kultivar Nipponbare hasil transformasi menggunakan konstruksi Oshox4 yang dikontrol oleh promoter 35S. A. Verifikasi Northern pada tanaman dengan ekspresi Oshox4 yang meningkat. B adalah kontrol tanaman mengandung konstruksi pDR5-GUS. C. Kelompok transgenik dengan tingkat Oshox4 yang meningkat dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif sedang, dan D. fenotipe pertumbuhan vegetatif tereduksi berat Penurunan tinggi tanaman pada tanaman padi transgenik yang mengandung Oshox 4 diakibatkan oleh panjang ruas batang Gambar 29 dan daun bendera Gambar 30 mengalami reduksi. Pengukuran panjang ruas batang pertama, ke dua dan ke tiga menunjukkan adanya reduksi yang cukup signifikan antara tanaman padi transgenik Oshox4 dengan tanaman kontrol Gambar 29A. Pengukuran ruas batang dilakukan untuk melihat besarnya reduksi tinggi tanaman yang terjadi. Elongasi ruas batang memberikan kontribusi pada tinggi tanaman padi. Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 67 Reduksi ruas batang ini lebih disebabkan oleh pengurangan ukuran batang secara longitudinal panjang ruas batang daripada oleh transversal diameter batang Gambar 29B. Terbukti dengan adanya reduksi panjang sel yang terjadi pada sayatan jaringan ruas batang secara longitudinal Gambar 29D F, sementara pada sayatan jaringan ruas batang secara tranversal tidak menunjukkan reduksi ukuran sel Gambar 29C D. Gambar 29 Analisis panjang ruas batang. Daerah berwarna gelap pada A dan B adalah 35S-Oshox4, sementara daerah berwarna putih pada A dan B adalah kontrol. C sayatan transversal dan D sayatan longitudinal pada ruas batang kontrol. E dan F adalah sayatan transversal dan longitudinal ruas batang padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4. Anak panah menunjukkan daerah sel yang diukur. Angka 1,2, dan 3 menunjukkan posisi ruas batang yang diamati. Reduksi ruas batang ini lebih disebabkan oleh pengurangan ukuran batang secara longitudinal panjang ruas batang daripada oleh transversal diameter batang Gambar 29B. Terbukti dengan adanya reduksi panjang sel yang terjadi Formatted: Swedish Sweden Formatted: Right: 0 cm Formatted: Spanish Mexico Formatted: French France Formatted: French France Formatted: French France 68 pada sayatan jaringan ruas batang secara longitudinal Gambar 29D F, sementara pada sayatan jaringan ruas batang secara tranversal tidak menunjukkan reduksi ukuran sel Gambar 29C D. Penurunan panjang daun bendera pada tanaman padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4 cukup sigfnifikan, hampir 10 cm perbedaan panjangnya dengan tanaman kontrol Gambar 30A. Penurunan ini diakibatkan oleh ukuran sel pada tanaman trangenik padi ternyata lebih kecil daripada tanaman padi kontrol Gambar 30B. Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 69 Penurunan panjang daun bendera pada tanaman padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4 cukup sigfnifikan, hampir 10 cm perbedaan panjangnya dengan tanaman kontrol Gambar 30A. Penurunan ini diakibatkan oleh ukuran sel pada tanaman trangenik padi ternyata lebih kecil daripada tanaman padi kontrol Gambar 30B. Gambar 30 Panjang daun bendera tanaman padi dengan Oshox4 yang berlebih. A. Panjang daun bendera; B. Panjang sel longitudinal dari daun bendera. C. Sayatan longitudinal daun bendera kontrol. D Sayatan longitudinal daun bendera tanaman 35S-Oshox4. Fenotipe padi 35S-Oshox4 tidak memunculkan nodus leher batang karena selubung daun dari daun bendera lebih panjang daripada ruas batang pertama. Kondisi ini mengakibatkan sebagian lema dan palea padi 35S-Oshox4 tidak muncul. Keadaan ini berakibat pada jumlah biji yang dihasilkan padi 35S-Oshox4 relatif sedikit dibanding tanaman padi kontrol. Sedikitnya jumlah biji yang dihasilkan diduga juga disebabkan tidak sempurnanya polen yang terbentuk. Dugaan ini diperkuat oleh kenyataan bahwa jumlah bulir padi yang hampa lebih banyak terjadi pada padi 35S-Oshox4 Gambar 31G daripada tanaman kontrol, sedangkan panjang malai utama, jumlah cabang primer dan sekunder malai tidak Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 70 memperlihatkan perbedaan antara padi 35S-Oshox4 dengan tanaman kontrol Gambar 31I. Gambar 31 Fenotipe malai. A: Lem n a dan palea kontrol; B: Organ reproduksi kontrol; C: Polen kontrol panah menunjukkan bentuk polen normal. D: Lem n a dan palea 35S-Oshox4; E: Organ reproduksi 35S-Oshox4; F: Polen 35S-Oshox4 panah menunjukkan bentuk polen normal; G: Jumlah bunga yang dihasilkan tiap malai dan jumlah bunga yang tidak menjadi biji hampa, 35S-Oshox4 ditandai dengan warna abu-abu; H: Perbandingan panjang selubung daun dari daun bendera pada ruas batang pertama, ruas batang pertama ditandai dengan warna putih; I: perbandingan ukuran sumbu p ae nikel, cabang primer dan sekunder, 35S-Oshox4 ditandai dengan warna abu-abu. Tanaman padi transgenik mengandung konstruksi gen 35S-Oshox4 memperlihatkan fase vegetatif yang lebih lama Gambar 32. Transgenik 35S- Oshox 4 berbunga lebih lama daripada tanaman padi kontrol. Tanaman 35S- Oshox 4 baru menghasilkan bunga setelah umurwaktu empat bulan sementara Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 71 kontrol telah menghasilkan biji pada waktu yang sama. Akan tetapi tanaman padi 35S-Oshox4 tidak tidak banyak menghasilkan benih yang fértil. Gambar 32 Fenotipe tanaman 35S-Oshox4 pada umur 2,4, dan 10 bulan. 1.4.2 Uji kekeringan pada tanaman Arabidopsis A. thaliana yang mengandung ekspresi Oshox4 Tingkat ketahanan tanaman tahan kekeringan yang mengandung Oshox4 diuji pada tanaman model A. thaliana. Transgenik A. thaliana mengandung 35S- Oshox 4 mampu bertahan dari kekeringan selama 21 hari Gambar 33. Tanaman A. thaliana transgenik 35S-Oshox4 AT4-1 dari dua ulangan dengan jumlah tanaman sebanyak 20 tiap ulangannya, lebih dari 90 tanaman yang masih dapat bertahan dan pada AT4-8 hanya sekitar 10 yang dapat hidup. Sementara itu pada blok pertama percobaan tanaman control 35S-hph K-1 sekitar hampir 20 tanaman yang bertahan hidup Gambar 33C. Kondisi kekeringan lebih dari 21 hari mengakibatkan tanaman A. thaliana transgenik Oshox4 tidak bisa bertahan hidup lebih lama. Setelah 30 hari dalam kondisi kekeringan tidak satupun tanaman transgenik A. thaliana mengandung 35S-Oshox4 yang dapat hidup. Fenotipe transgenik A. thaliana 35S-Oshox4 menunjukkan penurunan tinggi yang tidak begitu nyata dibanding transgenik 35S-hph kontrol. Penurunan tinggi pada tanaman A. thaliana berhubungan dengan penurunan jumlah dan elongasi sel seperti pada transgenik padi 35S-Oshox4 belum diketahui. Formatted: Font: I talic Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 72

1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4