49
proteinase kentang, angka menunjukkan ukuran nukleotida apabila dipotong dengan restriksi enzim tertentu.
3.2.2 Transformasi konstruksi gen PSA ke tanaman padi Nipponbare
Transformasi padi yang menggunakan Agrobacterium A. tumefaciens
sebagai vektor dilakukan berdasarkan Hiei et al. 1994. Kultur Agrobacterium A.
tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung konstruksi gen ditumbuhkan pada
medium ko-kultivasi yang mengandung asetosiringon 100 mM. Ko-kultivasi
bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens
dilakukan sampai OD
600
Agrobacterium = 1.
Populasi bakteri ini selanjutnya dipakai untuk proses transformasi. Kalus embriogenik yang berasal dari skutelum padi direndam kultur bakteri
AgrobacteriumA. tumefaciens selama 15 menit pada suhu ruang. Setelah itu kalus
ditransfer ke media padat dan diinkubasi selama 72 jam pada ruang gelap pada suhu 25
o
C. Untuk membedakan antara tanaman transgenik dan non-transgenik
kultur diseleksi dengan menggunakan antibiotik higromisin 50 mgl. Seleksi pada media antibio
t ik dilakukan selama 2-3 minggu. Setelah itu, kultur kalus yang
berhasil lolos dari media seleksi diinduksi tunas dan akarnya pada media regenerasi yang mengandung IAA indole acetic acid 0.5 mgL dan BAP 6-
benzilaminopurin 3 mgL di kondisi terang 12 jam dan gelap 12 jam.
3.2.3 Analisis molekular ekspresi gen entC dan pmsB pada tanaman padi
transgenik Nipponbare
T-DNA yang disisipkan pada genom padi Nipponbare untuk ekspresi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri mengandung tiga buah
ekspresi gen yaitu gen hph, entC, dan pmsB. Verifikasi keberadaan gen pada tingkat DNA dilakukan dengan analisis Southern. Southern blot dilakukan pada
membran nilon menggunakan bufer garam tinggi Ausebel et al. 2002. Hibridisasi untuk Southern dilakukan berdasarkan Memelink et al. 1994. DNA
genomik padi diisolasi dengan menggunakan bufer ekstraksi yang terdiri dari 1 volume 2x bufer isolasi, 1 volume 10 M urea, 5 fenol:klorofom:isoamilalkohol
25:24:1, dan 1 isoamilalkohol. Komposisi 2x bufer isolasi terdiri dari 0.6 M
Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic
Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic
Formatted: Subscript Formatted: Font: I talic
Formatted: Font: I talic
50
NaCl, 100 mM Tris pH 8.0, 40 mM EDTA, 4 N-Lauryl sarcosine, dan 1 sodium dodecyl sulfat. DNA selanjutnya diisolasi dengan ekstraksi fenol dan
pengendapan dengan etanol seperti dijelaskan dalam Ausubel et al. 2002. Untuk mengkonfirmasi ekspresi gen pada tingkat RNA dilakukan analisis Northern
seperti yang telah dijelaskan sebelumnya hal 32 .
3.2.4 Pengukuran asam salisilat dan asam salisilat glukosida
