Lokasi dan Waktu Penelitian Rancangan Penelitian

11

III. BAHAN DAN METODE

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Januari 2012 sampai Juni 2012 di Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan serta lahan milik CV. Meori Agro Jl. Atang Sanjaya KM 4 Pasir Gauk, Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminar air flow, autoclave , oven, mikroskop, spektrofotometer, refrigerator, inkubator, alat pengocok, timbangan, cawan petri, pipet, jarum ose, erlenmeyer, gelas ukur, tabung reaksi, kertas saring, aluminium foil, karet gelang, spidol, plastik, polibag, dan pot.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain contoh tanah dari lahan milik CV. Meori Agro untuk mendapatkan isolat bakteri pelarut fosfat dari tanah, isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro Tabel 1, media SPA Sucrose Potatoes Agar sebagai media biakan isolat bakteri koleksi, media Pikovskaya, media Nutrient Broth, aquades, larutan fisiologis, larutan PB dan PC, larutan standar 50 ppm P, alkohol, bibit tanaman sawi sendok berumur 2 minggu, dan pupuk kandang. Tabel 1. Asal Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi Kode Bakteri Asal Isolat Burkholderia sp. PS4 Rizosfer Tanaman Nilam Pseudomonas aeruginosa P2 Rizosfer Tanaman Kacang Tanah Bacillus subtilis J2 Rizosfer Tanaman Jagung 11

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Pengambilan Contoh Tanah

Pengambilan contoh tanah dilakukan di sekitar rizosfer tanaman jagung ± 2 kg dengan metode komposit yang kemudian tanah tersebut dikeringudarakan.

3.3.2 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah

Tahapan isolasi dilakukan dengan memasukkan 10 gram tanah ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 90 ml larutan fisiologis, dikocok 120 rpm selama 30 menit pada suhu ruang yang kemudian dibuat seri pengenceran sampai 10 -5 . Sebanyak 1 ml dari seri pengenceran 10 -3 , 10 -4 dan 10 -5 dituang di atas permukaan media Pikovskaya padat, kemudian disebar secara merata menggunakan batang penyebar dan diinkubasi selama 2-3 hari. Selanjutnya tahap pemurnian dilakukan dengan memurnikan antara koloni bakteri dengan koloni fungi yang tumbuh dengan menggoreskan koloni bakteri pada media Pikovskaya padat yang baru pada cawan petri dengan menggunakan metode gores. Isolat bakteri yang telah dimurnikan kemudian diinkubasi selama 3-4 hari.

3.3.3 Peremajaan Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi

Ketiga isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro digoreskan pada media SPA menggunakan jarum ose. Perlakuan tersebut dilakukan di dalam laminar air flow agar tidak terjadi kontaminasi.

3.3.4 Pengujian Kualitatif Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah dan

Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi Isolat bakteri pelarut fosfat koleksi yang telah diremajakan diuji kemampuannya dalam melarutkan fosfat. Pengujian pelarutan fosfat menggunakan media Pikovskaya. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media Pikovskaya dicampur, dan diberi aquades sampai batas volume yang diinginkan kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah media dingin, kemudian dituangkan ke cawan petri dan ditunggu hingga membeku, perlakuan ini dilakukan di dalam laminar air flow. Isolat yang telah diremajakan diambil koloninya dengan menggunakan jarum ose kemudian digoreskan pada media Pikovskaya. Pengamatan dilakukan sampai terbentuknya zona bening di sekitar bakteri yang menandakan terjadinya pelarutan fosfat. Isolat bakteri pelarut fosfat dari tanah yang telah diinkubasi 3-4 hari diamati pertumbuhannya. Uji kualitatif dilakukan dengan cara menghitung besarnya zona bening yang terbentuk dengan menggunakan Indeks Pelarutan IP Gambar 1. IP = A B Gambar 1. Indeks Pelarutan Fosfat Keterangan : A = diameter zona bening B = diameter koloni bakteri Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dengan metode gores pada cawan petri dan disimpan di dalam medium agar miring Pikovskaya. Kemampuan mikrob melarutkan fosfat dijadikan dasar untuk pemilihan mikrob unggul. Mikrob pelarut fosfat yang paling unggul digunakan untuk pengujian selanjutnya.

3.3.5 Pengujian Kuantitatif Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah dan

Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi Pengujian kuantitatif dilakukan menggunakan media Pikovskaya cair. Isolat koleksi yang telah diremajakan serta isolat bakteri tanah diambil koloninya sebanyak 1 ml kemudian ditumbuhkan pada media Pikovskaya cair dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur diinkubasi dengan pengocokan 100 rpm secara periodik. Setelah masa inkubasi, isolat bakteri yang telah tumbuh diambil koloninya kemudian disentrifugasi 1048 x g selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh lalu ditambahkan 5 ml larutan PB dan 5 tetes larutan PC. Selain itu juga mempersiapkan larutan standar 50 ppm P 0 ppm – 10 ppm dan ditambahkan pula 5 ml larutan PB dan 5 tetes larutan PC kemudian diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Supernatan yang dihasilkan dari hasil sentrifus diukur pelarutan fosfatnya dengan menggunakan spektrofotometer dan dibandingkan dengan kontrol. Masing-masing perlakuan dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali.

3.3.6 Metode Pengukuran P dalam Larutan

Supernatan yang dihasilkan diencerkan hingga 50 kali kemudian dianalisis P terlarut dengan menggunakan metode Bray-1. Analisis yang digunakan menggunakan larutan standar 50 ppm dengan seri pengenceran 0-10 ppm P. Larutan ini dibuat dari larutan baku yang mempunyai konsentrasi lebih tinggi kemudian diencerkan dengan larutan Bray-1. Sebanyak 5 ml larutan PB dan 5 tetes larutan PC ditambahkan ke dalam 5 ml supernatan. Jumlah P larut diidentifikasi melalui intensitas warna biru dari larutan dengan metode kolorimetri fosfomolibdat. Intensitas warna biru dari larutan dibaca pada gelombang 660 nm dengan spektrofotometer Sulaeman et al., 2005.

3.3.7 Uji Antagonis Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah dan Isolat

Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi jika dikombinasikan secara in vitro Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji antagonis yaitu isolat koleksi CV. Meori Agro Burkholderia sp. PS4, Pseudomonas aeruginosa P2, Bacillus subtilis J2 dan isolat bakteri pelarut fosfat dari tanah IS9. Satu koloni bakteri yang tumbuh terpisah pada media SPA di cawan petri diambil dengan menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media SPA yang telah disiapkan. Pengujian antagonis empat isolat bakteri dilakukan dengan metode uji berpasangan pada media SPA Gambar 2, 3 dan 4. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan cara mengamati pertumbuhan empat bakteri secara bersama-sama. Masing-masing perlakuan dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali. Gambar 2. Metode Uji Antagonistik Dua Isolat Bakteri Gambar 3. Metode Uji Antagonistik Tiga Isolat Bakteri Isolat Bakteri 2 Petridisk Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 2 Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 3 Petridisk Gambar 4. Metode Uji Antagonistik Empat Isolat Bakteri

3.3.8 Pengaruh Bakteri Pelarut Fosfat serta Kombinasinya pada

Pertumbuhan Sawi Sendok 1. Persiapan Inokulan Isolat koleksi maupun isolat asal tanah yang terpilih masing-masing dipindahkan ke dalam 100 ml media Nutrient Broth dengan menggunakan jarum ose untuk dibiakan di atas mesin pengocok selama 3 hari. Pada hari ketiga diukur nilai rapat optis suspensi tersebut dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm untuk memperoleh jumlah sel per milimeter suspensi. Penentuan populasi sel ini dilakukan dengan memasukkan nilai rapat optis pada persamaan kurva baku masing-masing bakteri. Kurva baku ini digunakan untuk menghitung jumlah sel isolat yang akan diinokulasikan.

2. Penanaman dan Perlakuan Bibit Tanaman Sawi Sendok

Benih sawi sendok ditumbuhkan pada media tanah dan menggunakan pupuk kandang 5 g polibag hingga berumur dua minggu di persemaian. Kemudian bibit tanaman sawi sendok dipindahkan ke polibag dan diberi perlakuan bakteri dengan kepadatan bakteri 10 8 selml dengan cara menuangkan suspensi pada permukaan tanah, lalu diletakkan di dalam rumah kaca dan diamati pertumbuhannya. Penyiraman dilakukan setiap hari dengan mempertahankan Isolat Bakteri 3 Petridisk Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 2 Isolat Bakteri 4 kadar air tanah pada keadaan 80 kapasitas lapang. Pertumbuhan tanaman sawi sendok di rumah kaca diamati selama lima minggu. Kombinasi perlakuan bakteri dengan pupuk SP-36 dapat dilihat di Tabel Lampiran 21.

3. Pengamatan Pertumbuhan Tanaman Sawi Sendok di Rumah Kaca

Setelah tanaman sawi sendok mencapai masa akhir vegetatif 5 minggu setelah tanam, tanaman diambil untuk pengamatan tinggi tanaman, lebar daun, jumlah daun, biomassa segar dan kering serta kandungan P di dalam jaringan tanaman.

3.4 Rancangan Penelitian

Rancangan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap dengan dua faktor perlakuan, yaitu : 1. Pemberian isolat bakteri pelarut fosfat, terdiri dari 16 taraf, yaitu isolat bakteri kode IS9, J2, P2, PS4, J2+IS9, J2+PS4, P2+IS9, P2+J2, P2+PS4, PS4+IS9, J2+PS4+IS9, P2+J2+IS9, P2+J2+PS4, P2+PS4+IS9, P2+J2+PS4+IS9, dan kontrol tanpa isolat bakteri pelarut fosfat. Keterangan : IS9 Burkholderia sp., P2 Pseudomonas aeruginosa, J2 Bacillus subtilis, dan PS4 Burkholderia sp.. 2. Pemberian dosis pupuk SP-36, terdiri dari 3 taraf, 50 dosis pupuk SP-36 0,059 gpolibag, 75 dosis pupuk SP-36 0,089 gpolibag, dan 100 dosis pupuk SP-36 0,118 gpolibag. Percobaan diulang sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh 16 x 3 x 3 = 144 satuan percobaan. Menurut Gaspersz 1991 model statistika untuk percobaan dengan menggunakan rancangan acak lengkap RAL faktorial adalah sebagai berikut : Yijk = µ + αi + βj + αβij + Eijk Di mana : µ : Rata-rata nilai tengah respon αi : Pengaruh perlakuan ke-i yang akan diuji βj : Efek dari pengaruh faktor perlakuan pada taraf ke-j αβij : Pengaruh interaksi antara faktor perlakuan ke-i dan faktor perlakuan ke-j E ij : Pengaruh komponen galat atau error dari faktor perlakuan ke-i dan faktor perlakuan ke-j pada ulangan ke-k Y ijk : Respon terhadap perlakuan faktor ke-i dan faktor ke-j pada ulangan ke-k Data diolah dengan menggunakan analisis sidik ragam, apabila hasil uji F hitung lebih besar dari F tabel, maka analisis dapat dilanjutkan dengan menggunakan uji beda nyata Duncan. Gambar 1. Diagram Alir Pembiakan Bakteri Pelarut Fosfat serta Aplikasinya ke Tanaman Isolasi Isolat BPF Tanah Pelarut Fosfat Pemurnian Isolat BPF Tanah Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P Penyimpanan Isolat BPF Tanah Uji Kualitatif Uji Kuantitatif Peremajaan Tiga Isolat BPF Koleksi Pengambilan Sampel Tanah Uji Antagonis Pemindahan Isolat Terpilih ke Media NB Pemindahan Isolat Terpilih ke Media NB Pupuk Kandang dan Pupuk SP-36 Aplikasi ke Tanaman Sawi 20

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisis Tanah

Hasil analisis sifat-sifat kimia dan fisik tanah awal Inceptisol disajikan pada Tabel 2 dan kriteria penilaian analisis sifat kimia tanah PPT 1983 yang digunakan disajikan pada Tabel Lampiran 1. Tabel 2. Sifat Inceptisol yang digunakan sebagai media Jenis Analisis Metode Alat Analisis pH H2O pH-meter 5,2 pH KCl 1 M pH-meter 4,77 C-organik Walkey Black 1,27 N-total Kjeldahl 1,75 CN ratio - 0,72 P tersedia ppm Bray I 5,17 Ca-dd cmol+kg Perkolasi dengan amonium asetat 1 M pH 7 8,51 Mg-dd cmol+kg Perkolasi dengan amonium asetat 1 M pH 7 2,43 K-dd cmol+kg Perkolasi dengan amonium asetat 1 M pH 7 0,19 Na-dd cmol+kg Perkolasi dengan amonium asetat 1 M pH 7 - Fe AAS 1,18 P total Spektrofotometer 0,08 Berdasarkan Tabel 2, Inceptisol menunjukkan reaksi masam dengan nilai pH yaitu sebesar 5,2 serta memiliki kandungan C-organik yang tergolong rendah yaitu sebesar 1,27 . Menurut Sanchez 1992, hal ini diduga karena tanah-tanah tersebut telah mengalami pencucian dan pelapukan lanjut serta